影響核桃粕蛋白溶出率的提取條件

劉猛，李祥，樊鳳嬌

1. 呂梁學院生命科學系（呂梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3. 南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院（南京 210023）

現(xiàn)代科學研究表明，核桃對人的顱腦神經(jīng)具有很好的保健功能。一直以來，人們由于只重視其健康價值和核桃油方面的研究，而忽略在脫脂核桃蛋白的利用率等方面的研究[1]。由于核桃富含多種礦物質元素，具有豐富的營養(yǎng)價值，可以起到增強大腦記憶力的作用[2]。我國核桃產(chǎn)量最近幾年也一直呈線性增長趨勢，關于核桃產(chǎn)品的研發(fā)與利用逐漸成為市場和企業(yè)熱點[3]。珠娜等[4]、余永婷等[5]、劉剛等[6]對于核桃蛋白以及相關蛋白開展深入研究；在國內(nèi)關于核桃蛋白質研究方面的報道比較少，尤其是對核桃蛋白功能研究方面更是罕見[7]。Gu等[8]、Xu等[9]對核桃蛋白肽對于人和動物生命活動開展深入研究。核桃蛋白中有大量的谷蛋白，脫脂核桃粉可用于啤酒酵母發(fā)酵[10]，溶解性極差，一般采用高速剪切進行處理核桃[11]，因此很難將核桃相關產(chǎn)品應用于在乳飲料中[12]。核桃蛋白功能特性方面的研究，在對蛋白質溶解度的探究方面相對集中[13]。由此，試驗探究不同加工條件下核桃蛋白質溶出率變化，對核桃蛋白的加工與應用提供技術支撐[14]。核桃乳飲料[15]中含有適量維生素、蛋白質、煙酸和其他微量元素，并且含有核桃獨有的產(chǎn)品風味[16]。經(jīng)常食用核桃相關產(chǎn)品，可以增強體魄、滋補顱腦神經(jīng)、提高免疫能力[17]。與其他飲料相比，對鐵、鈣吸收較差的人群有較理想的改善效果[18]。

這幾年，關于核桃分離蛋白特性的研究較多，核桃濃縮蛋白和分離蛋白產(chǎn)品沒有產(chǎn)業(yè)化、模式化，核桃蛋白分離純化，通常使用酸沉堿提法或者聯(lián)用一些輔助設備進行蛋白提取[19]。由于一些殼和皮沒有被去除干凈，因此榨取核桃油時，使獲得的核桃粕中帶有雜質，從而影響到蛋白質的結構及一些功能特性，而且提取率偏低，有比較嚴重的蛋白損失和浪費[20]。然而，有尚未應用于核桃蛋白的制備方法如基于乙醇浸漬法濃縮的蛋白質[21]，其未使用的主要原因是核桃油和蛋白質的利用率不能形成產(chǎn)業(yè)鏈，導致一定雜物殘留，乙醇浸漬法的應用因核桃皮被限制[22]。核桃蛋白作為一種優(yōu)質的植物蛋白資源，使核桃蛋白在工業(yè)生產(chǎn)和新產(chǎn)品的研發(fā)中，為社會創(chuàng)造更多的價值[23]。

試驗為探究核桃蛋白質溶出率的影響因素，設置不同加工條件，采用單因素試驗法，結合正交試驗分析，得出酸沉堿提法分離蛋白的最佳加工條件，為擴大核桃分離蛋白在食品行業(yè)的應用，支撐核桃飲料及其核桃功能產(chǎn)品研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

核桃餅粕；石油醚（分析純，北京宏宇化學試劑公司）；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸溶液、甲基紅-亞甲基藍指示劑（均為分析純，上海鷗科蜜化學試劑有限公司）；BCA試劑盒（生化試劑，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 試驗儀器與設備

PHBJ-260 pH計（上海東方科學儀器股份有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SC-04離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SP21-318C酶標儀（北京中西遠大科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃粕的預處理

使用粉碎機把核桃餅粕粉碎至粉末狀。

1.3.2 核桃蛋白的分離純化

采用酸沉堿提法分離純化核桃蛋白質。工藝流程：稱取適量核桃餅粕，以一定比例將其與蒸餾水進行混合，用氫氧化鈉溶液進行樣品pH調(diào)節(jié)，設置3 000 r/min離心機轉速，進行10 min的離心操作，為調(diào)節(jié)pH至等電點將上層清液進行加酸操作，再次進行離心，核桃蛋白經(jīng)沉淀干燥后在下層。

1.3.3 蛋白質含量的測定

通過凱氏定氮法進行核桃總蛋白質含量的測定，蛋白質含量按式（1）計算。

式中：X為食品中蛋白質的含量，g/100 g；V為滴定試樣每消耗0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；V0為空白試驗時每消耗0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；c為鹽酸標準滴定溶液的物質量濃度，mol/L；0.014為1 mL物質的量為1 mol/L鹽酸標準滴定溶液等價于氮的質量，g；m為試樣的質量，g；F為氮換算為蛋白質的系數(shù)，一般為6.25。

1.3.4 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）測蛋白質濃度[24]

利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.4 單因素試驗

1.4.1 不同pH條件處理

堿液浸提核桃蛋白過程，通過調(diào)節(jié)核桃蛋白樣品的pH控制體系變量。準確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH分別為7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，進行60 min的攪拌，進行時長30 min、溫度60℃的熱處理，以室溫為標準冷卻，進行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究pH對核桃蛋白溶出率的影響。

1.4.2 不同浸提時間處理

堿液浸提核桃蛋白過程中，通過控制核桃蛋白樣品的時間控制體系變量。準確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH為7.0，分別浸提30，45，60，75和90 min，在60 ℃的溫度下進行30 min預處理，以室溫為標準進行冷卻，提取核桃餅粕蛋白，研究浸提時間對核桃餅粕蛋白溶出率影響情況。

1.4.3 不同浸提溫度處理

堿液浸提核桃蛋白過程中，通過控制堿液浸提的溫度，來控制體系變量。準確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH 7.0為攪拌，攪拌60 min。分別在溫度20，40，60，80和100 ℃下熱處理30 min，冷卻至室溫，進行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究浸提溫度對核桃餅粕蛋白溶出率影響情況。

1.4.4 不同料液比處理

堿液浸提核桃蛋白過程中，改變樣品與蒸餾水比例控制體系條件的改變。準確稱取2 g核桃餅粕，體系的溫度控制在60 ℃，確保浸提時間60 min，pH 7.0，設置5個料液比水平（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL），進行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究料液比對核桃餅粕蛋白溶出率的影響情況。

1.4.5 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，以pH、料液比、溫度和時間為因素進行四因素三水平正交試驗設計，以核桃蛋白質溶出率為指標，對結果進行分析處理。

1.4.6 核桃蛋白質溶出率的計算

將經(jīng)過不同條件處理的核桃餅粕樣品，經(jīng)過酸沉堿提工藝處理后，將上層清液取出，通過酶標儀法測定可溶性蛋白質的含量，蛋白質溶出率按式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 蛋白質總含量的測定

通過凱氏定氮法測定蛋白質的總蛋白質含量，核桃粕中蛋白質含量為70%，與相關文獻中所得出的蛋白質含量對比可得出，試驗所使用的核桃粕有較高的蛋白質含量

2.2 蛋白質標準曲線

蛋白質標準曲線如圖1所示。通過BCA法測定得到的蛋白質濃度標準曲線為y=0.897 37x+0.078 46（R2=0.996 78），蛋白質濃度由回歸方程計算。

圖1 蛋白質標準曲線

2.3 單因素試驗結果分析

2.3.1 pH對核桃蛋白質溶出率的影響

由圖2可知：隨著pH變大，核桃蛋白質溶出率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，核桃蛋白質溶出率達到峰值72.25%，此時的pH為10.0；pH 11時，其溶出率為70.12%。因此，選取pH 9.0，10.0和11.0進行正交試驗。

圖2 pH對溶出率的影響

2.3.2 浸提時間對核桃蛋白質溶出率的影響

浸提時間對核桃蛋白質溶出率結果的影響曲線圖如圖3所示。不同時間時，其核桃蛋白質溶出率分別為8.56%，9.08%，9.13%，9.12%和9.11%。隨著浸提時間的增加，核桃蛋白溶出率逐漸增加，達到60 min時，增加趨于平緩。所以，選取浸提時間45，60和75 min進行正交試驗。

圖3 時間對溶出率的影響

2.3.3 溫度對核桃蛋白質溶出率的影響

浸提溫度對核桃蛋白質溶出率的影響結果曲線圖如圖4所示。核桃蛋白質在取不同溫度時的溶出率分別為6.05%，7.95%，9.08%，8.76%和8.56%。浸提溫度達到60 ℃時，核桃蛋白溶出率最高，且隨著溫度的升高，變化趨于平緩。因此，選取溫度40，60和80 ℃進行正交試驗。

圖4 溫度對溶出率的影響

2.3.4 料液比對核桃蛋白質溶出率的影響

料液比對核桃蛋白質溶出率的影響結果曲線圖如圖5所示。核桃蛋白質在取不同料液比時的溶出率分別為8.96%，9.11%，9.08%，9.07%和9.07%。當料液比達到1∶15（g/mL）時，核桃蛋白溶出率達到最大，且隨著料液比的繼續(xù)增加，核桃蛋白溶出率有所下降且趨于平緩。因此在選擇正交試驗因素水平時，選取的水平為1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）。

圖5 料液比對溶出率的影響

2.4 正交試驗結果

通過單因素試驗篩選出對核桃蛋白質溶出率的影響較大的4個因素：pH、溫度、時間、料液比（分別以A、B、C、D表示）。選取這4個因素為自變量，以蛋白質溶出率為指標，進行四因素三水平正交試驗，每個試驗因素選取水平見表1，通過試驗所得正交試驗結果見表2。

表1 因素與水平表

表2 L9(34)方案及結果分析

從極差分析結果可以看出，RA＞RD＞RB＞RC，即對核桃蛋白質溶出率的影響因素主次所產(chǎn)生影響的順序為pH＞料液比＞溫度＞時間。通過比較得到最優(yōu)方案為A2B3C1D2，即pH 10.0、溫度80 ℃、時間45 min、料液比1∶15（g/mL），經(jīng)過試驗得到該條件下核桃蛋白質的溶出率為70.87%。

3 結論

以核桃餅粕為原料，采用酸沉浸提法分離核桃蛋白，通過單因素試驗，研究不同pH、溫度、時間、料液比水平大小對核桃蛋白質溶出率的影響情況，根據(jù)正交試驗結果，探究核桃蛋白提取的最佳工藝條件。酸沉堿提工藝在通過正交試驗后確定的最優(yōu)條件為pH 10.0、溫度80 ℃、時間45 min、料液比1∶15（g/mL），在該工藝下的核桃蛋白質溶出率最高，溶出率為70.87%。