棠梨果中單寧的提取工藝優(yōu)化

徐陽純，王志強(qiáng)，李栩欣，許澤群，彭焱輝

廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510070）

棠梨異名杜梨、川梨、鹿梨、海棠梨，云南本土稱為棠梨刺，也有個別地方喚野梨子或鳥梨[1-3]。棠梨是多年生落葉果樹，棠梨分布廣，常見于中國南部、北部、東北部和中部，長江中下游流域，如四川、廣東、江西、云南，貴州等，屬于薔薇科梨屬落葉喬木[4-6]。在云南地區(qū)，棠梨植株常見于海拔1 000～2 800 m的山林荒野間地梗邊，自然成林，儲量豐富，由于根系發(fā)達(dá)，棠梨樹能夠抵抗貧瘠，有良好的適應(yīng)性和抗性，是防護(hù)林和沙荒地造林的珍貴物種[7-8]。

棠梨集食用、藥用、材用和園林綠化于一身，綜合利用價值非常高，樹干可用于人工栽培嫁接繁殖梨的砧木，果實(shí)可作為食品加工制作主要原材料，其花還可用于觀賞[9-12]。據(jù)研究，棠梨葉能夠潤肺止咳，清熱解毒，疏肝和胃，緩急止瀉[13]；棠梨花功效有降血脂和清理腸胃，是云南人民喜愛的食療蔬菜之一[14]；棠梨果有降血糖、消除積食、通二便、斂肺澀腸功能，可治療產(chǎn)后血瘀作痛。據(jù)《本草綱目》記載：味酸、甘、澀、寒；無毒[15]。燒熟食用，可治泄瀉痢疾[16]。對棠梨果實(shí)營養(yǎng)成分及功效成分方面研究較少，其中：王志強(qiáng)等[17]對棠梨中礦物質(zhì)元素進(jìn)行分析，棠梨中含有豐富的P、K、Ca、Mn、Fe、B、Sr等礦物元素；趙小亮等[18]運(yùn)用超聲-微波協(xié)同萃取法并用蒽酮-硫酸比色法對棠梨果實(shí)多糖含量進(jìn)行了分析；陳玉琴等[19]對棠梨中多糖及其流變性進(jìn)行研究。對棠梨果實(shí)中其他營養(yǎng)成分及功效成分研究有待進(jìn)一步開展。單寧，又稱鞣質(zhì)、單寧酸，是多元苯酚類衍生物，有多重功效，如抗病毒活性、收斂、抗腫瘤活性，并能與自由基發(fā)生反應(yīng)，具有很強(qiáng)的抗氧化能力等[20-21]。試驗(yàn)用磷鉬酸、鎢酸鈉為顯示劑，采用分光光度法測定單寧含量，優(yōu)化提取條件[22-24]，分析影響提取液保存條件，為棠梨果實(shí)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

棠梨果（2019年10月，采自四川省阿壩藏族羌族自治州金川縣梨園基地）。

單寧酸對照品（阿拉?。?；無水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠）；鎢酸鈉、鉬酸鈉、碳酸鈉等（均為分析純試劑）；水（均為實(shí)驗(yàn)室三級水）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BS224S電子天平（賽多利斯）；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（上海漢諾儀器有限公司）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；WTS-200紫外可見分光光度計(jì)（上?；鄱嘈畔⒖萍及l(fā)展有限公司）；低溫恒溫槽（上海漢諾儀器有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

單寧提取工藝：新鮮棠梨果子→去雜→清洗→棠梨果烘干→粉碎→過篩→提取→離心→單寧粗提液。

2.1 試劑溶液

2.1.1 乙醇溶液

25%，50%，75%和90%乙醇溶液。

2.1.2 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液

取50.0 g鎢酸鈉和12.5 g鉬酸鈉到燒杯中，加入350 mL三級水進(jìn)行溶解，用移液管加入25 mL磷酸和50 mL鹽酸到溶液中，攪拌均勻后接上回流裝置回流，2 h后繼續(xù)加入5.0 g硫酸鋁，加入幾滴溴水后繼續(xù)加熱15 min，冷卻后定容到500 mL，過濾于棕色瓶中保存。

2.1.3 碳酸鈉溶液（75 g/L）

稱取75.0 g碳酸鈉，加入三級水溶解，冷卻至室溫后定容到1 000 mL容量瓶中。

2.1.4 單寧酸對照品溶液（204 mg/L）

準(zhǔn)確稱取0.020 4 g單寧酸試劑到100 mL容量瓶中，加入三級水溶解后定容到刻度。

2.1.5 單寧酸對照品使用溶液吸取10.00 mL單寧酸對照品溶液，稀釋到100 mL，搖勻待用，溶液的質(zhì)量濃度為20.4 mg/L。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 確定最大吸收波長

取1.0 mL 2.1.5小節(jié)所制使用溶液到10 mL比色管中，加入0.5 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液，用三級水定容到刻度上，搖勻靜待顯色反應(yīng)，120 min后用1 cm石英比色皿，參比試劑空白，在400～900 nm光區(qū)中進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長700 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取0.10，0.15，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL 2.1.4小節(jié)對照品溶液于10 mL比色管中，分別加入0.5 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液，用三級水定容到刻度上，搖勻靜待顯色反應(yīng)，120 min后用1 cm石英比色皿，參比試劑空白，在700 nm測定其吸光度。以單寧酸絕對量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 單寧提取及含量測定

稱取適量棠梨粉末到器皿中，按照一定的料液比加入相應(yīng)比例和體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，恒溫條件下提取一段時間后，將提取好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，上清液過濾至100 mL管中定容備用。準(zhǔn)確移取1.0 mL到10 mL比色管中，加入0.5 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液，用三級水定容到刻度上，搖勻靜待顯色反應(yīng)，120 min后用1 cm石英比色皿，參比試劑空白，在700 nm波長下測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣測定液絕對量C，按照式（1）計(jì)算試樣中單寧含量（mg/kg）。

單寧含量=C×k×V/（W×V1）/10 000 （1）式中：C為試樣測定液中單寧量，μg；k為稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；W為取樣量，g；V1為測定體積，mL。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 固液比對單寧提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱取3.30，2.50，2.00，1.67，1.25，1.00和0.50 g處理好的7份棠梨粉末到三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，蓋上玻片，同時在50 ℃、32 kHz條件下進(jìn)行超聲，提取30 min后，將提取好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，上清液過濾至100 mL管中定容備用。取1 mL提取液進(jìn)行顯色測定吸光度，分別比較不同固液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶80，1∶100和1∶200 g/mL）對單寧提取率的影響。

2.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響

分別稱取約1.67 g處理好的棠梨粉末到6個三角瓶中，分別加入100 mL不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，蓋上玻片，同時在50 ℃、32 kHz條件下進(jìn)行超聲，提取30 min后，將提取好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，上清液過濾至100 mL管中定容備用。取1 mL提取液進(jìn)行顯色測定吸光度，分別比較不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0，25%，50%，70%，90%和100%）對單寧提取率的影響。

2.4.3 提取方式對單寧提取率的影響

分別稱取約1.67 g處理好的棠梨粉末到6個三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，蓋上玻片，2個放入提前設(shè)置好50 ℃的電熱恒溫水浴鍋中，水浴浸提30 min，取出放置，冷卻至室溫；2個放進(jìn)50 ℃超聲波清洗儀，以32 kHz超聲30 min，取出冷卻；2個放進(jìn)50℃水浴恒溫振蕩器，水平振蕩30 min，取出。將提取好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，上清液過濾至100 mL管中定容備用。取1 mL提取液進(jìn)行顯色測定吸光度，分別比較不同提取方式（浸提、超聲、振蕩）對單寧提取率的影響。

2.4.4 提取時間對單寧提取率的影響分別準(zhǔn)確稱取6份1.67 g處理好的棠梨粉末到三角瓶中，各加入100 mL 50%乙醇溶液，蓋上玻片，同時在50 ℃、32 kHz條件下進(jìn)行超聲，提取不同時間后，將提取好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，上清液過濾至100 mL管中定容備用。取1 mL提取液進(jìn)行顯色測定吸光度，分別比較不同提取時間（30，40，60，80，100和120 min）對單寧提取率的影響。

2.4.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化單寧提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對棠梨中單寧提取率影響比較大的因素、較好的水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到提取棠梨中單寧的最優(yōu)因素水平。

2.4.6 考察溫度對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響

移取10.0 mL棠梨果單寧提取液，分別置于不同溫度（4，10，20，30，40，50和60 ℃）下于低溫恒溫槽恒溫1 h，取出，待至室溫顯色，在700 nm下測其吸光度，考察溫度對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響。

2.4.7 考察時間對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響

移取10.0 mL棠梨果單寧提取液，放置不同時間[0（現(xiàn)提），1，2，3，4，5和6 d]，顯色后于700 nm測其吸光度，考察時間對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響。

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 探究不同因素下對單寧提取的最佳條件

2.5.1.1 最優(yōu)固液比

固液比對單寧提取率的影響見圖1。

在一定范圍內(nèi)增高固液的比例對提高單寧提取率是有利的，主要原因是物料顆粒跟溶液之間保持合適的單寧濃度差有利于提取所需傳質(zhì)[16]。由圖1可知：隨著棠梨取樣量的減少（固液比增大），棠梨果中單寧提取率逐漸增大，固液比1∶60 g/mL時，單寧提取率達(dá)到最大量0.85%；繼續(xù)增大固液比例，單寧的提取率逐漸降低，主要原因可能為乙醇溶液比例過大時，棠梨果中其他成分溶出增加，降低單寧提取率。所以，選擇1∶60 g/mL為最優(yōu)固液比。

圖1 固液比的影響

2.5.1.2 最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)

溶液體積分?jǐn)?shù)對單寧提取率的影響見圖2。

提取過程中，溶液體積分?jǐn)?shù)對單寧的提取率有較大影響，一般情況下相對較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液更適用于單寧的提取，以此選擇合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)可以提高單寧的提取率。由圖2可知：乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～50%之間，單寧提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增多；乙醇體積分?jǐn)?shù)處于50%時，單寧提取率為1.19%，達(dá)到最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)＞50%時，單寧提取率明顯降低，可能原因是高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液使得一些醇溶性物質(zhì)，如色素和某些親脂性強(qiáng)的成分溶出增加，同單寧物質(zhì)競爭結(jié)合，導(dǎo)致單寧的提取不升反降。因此。選擇50%乙醇為最優(yōu)溶液。

圖2 溶液體積分?jǐn)?shù)的影響

2.5.1.3 最優(yōu)提取方式

提取方式對單寧提取率的影響見圖3。

圖3 提取方式的影響

在同樣溫度和時間下，3種提取方法以超聲萃取效果最好，單寧提取率為1.21%，可能是因?yàn)槌曁崛≈校曊駝赢a(chǎn)生的空化作用、擾動作用和攪拌作用等多重效用，使棠梨粉末中物質(zhì)分子運(yùn)動頻率和速度增大，增強(qiáng)穿透溶劑的能力，加速單寧成分的溶出，從而使3種不同的提取方法出現(xiàn)一定差異。因此，選擇超聲萃取法為最優(yōu)提取方式。

2.5.1.4 最優(yōu)提取時間

提取時間對單寧提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間的影響

提取時間小于100 min時，隨著提取時間增加，單寧萃取率逐步增多，原因是提取時間過短，則單寧萃取不完全，導(dǎo)致單寧提取率低；當(dāng)提取時間增長，破壁阻力逐漸減弱，破除細(xì)胞壁的效果增強(qiáng)，單寧提取率上升；提取達(dá)到100 min時，單寧含量達(dá)到最大值，為1.27%；提取超過100 min，單寧提取率無明顯變化，說明超聲100 min時棠梨中單寧基本萃取完全。因此，選擇100 min為最優(yōu)提取時間。

2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以對棠梨中單寧提取率影響較大的因素和較好的條件作為因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化出棠梨單寧提取的最佳條件，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)，棠梨單寧的最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D3，即固液比1∶60 g/mL、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)50%、超聲提取方式、提取時間120 min。4個因素對單寧提取率的影響順序?yàn)樘崛》绞剑–）＞乙醇溶液濃度（B）＞固液比（A）＞提取時間（D）。在優(yōu)化得到的棠梨果單寧提取最佳條件下，按照2.3小節(jié)提取棠梨果單寧，制作平行試樣3份，棠梨果單寧平均提取率為1.44%，SRSD為4.0%，回收率為83%，說明優(yōu)化的提取棠梨果單寧條件合理、穩(wěn)定、可行，可作為棠梨果單寧的提取最佳條件。

2.5.3 棠梨果單寧穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.5.3.1 溫度對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響

按照2.4.5小節(jié)得到吸光度與溫度的關(guān)系，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對穩(wěn)定性的影響

在4～30 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，棠梨果單寧液的吸光度變化不大，溫度高于30 ℃，棠梨單寧液的吸光度逐漸下降，說明棠梨單寧對高溫微敏感。所以，提取后的單寧液在30 ℃以下穩(wěn)定性較好，保存時最好低溫保存。

2.5.3.2 時間對棠梨果提取液穩(wěn)定性的影響

按照2.4.6小節(jié)，得到吸光度與時間的關(guān)系，結(jié)果見圖6。

圖6 時間對穩(wěn)定性的影響

在6 d范圍內(nèi)，吸光度變化小，但隨著時間延長，棠梨果單寧液的吸光度緩慢下降，但總體穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

探究棠梨中單寧提取的最優(yōu)條件以及棠梨果提取液穩(wěn)定性。結(jié)果表明，棠梨果中單寧提取的最優(yōu)條件：固液比1∶60 g/mL，溶液采用50%乙醇，提取方式采用超聲萃取法，提取時間120 min；單寧提取量的影響順序?yàn)樘崛》绞剑–）＞乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)（B）＞固液比（A）＞提取時間（D）。提取后的單寧液在30 ℃以下穩(wěn)定性較好，提取液保存環(huán)境應(yīng)低于30 ℃。