超聲細(xì)胞破碎法提取黑果枸杞原花青素

譚永鵬，李映偉，程建華*

1. 華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院（廣州 510640）；2. 華南協(xié)調(diào)創(chuàng)新研究院（東莞 523808）

黑果枸杞是茄科、枸杞屬多棘刺野生灌木植物，多分布在我國西北地區(qū)，可防止土壤沙漠化和鹽堿化，具有水土保持、防風(fēng)固沙和改善環(huán)境的功能[1-3]。黑果枸杞有“軟黃金”之譽，其果實呈黑紫色圓球狀，含有豐富的花色苷、氨基酸、多酚類化合物、生物堿類化合物等多種營養(yǎng)成分和生物活性成分，尤其含有豐富的天然原花青素，營養(yǎng)保健及藥用價值極高[4-7]。

原花青素是一大類多酚類化合物的總稱，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果、種子等部位，由于其能夠在熱酸性條件下產(chǎn)生花青素，因而被命名為原花青素[8]。原花青素是由不同數(shù)量的黃烷-3-醇單體聚合而成的高分子量多酚化合物，可以顯著清除自由基及抑制脂質(zhì)過氧化，是公認(rèn)的天然抗氧化劑和自由基清除劑[9-10]，具有抗紫外線、抗輻射、抗腫瘤、改善炎癥、調(diào)節(jié)免疫等多種生理作用，在食品、保健品、藥品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[11-12]。

以黑果枸杞為原料，采用超聲細(xì)胞破碎法對其中的原花青素進(jìn)行提取，具有操作簡單、便捷高效、提取率高、成本低等特點[13]；以原花青素得率為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化黑果枸杞原花青素的提取工藝，同時研究分析其抗氧化活性，為黑果枸杞的研究、開發(fā)和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞（青海諾木洪枸杞產(chǎn)業(yè)園區(qū)）；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；香草醛、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、DPPH、抗壞血酸、VC（阿拉?。?；無水乙醇、甲醇、濃鹽酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80型高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；U-2910型紫外可見光分光光度計（HITACHI公司）；JY92-Ⅱ N型超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；RV-3C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA儀器設(shè)備有限公司）；LGJ-12真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑果枸杞原花青素含量測定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用改良的濃鹽酸-香草醛法[14]測定原花青素的含量。稱取20 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至20 mL，配制成1 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取1，2，3，4和5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，各取1 mL至25 mL比色管中，依次加入6.0 mL 4%香草醛甲醇溶液和3.0 mL濃鹽酸，混勻后在30±1 ℃的恒溫水浴中避光反應(yīng)20 min，然后以甲醇溶液作為空白，在500 nm的波長下用紫外分光光度計測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.948x-0.000 8，R2=0.999 3，其中x為原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；y為500 nm下的吸光度。

1.3.1.2 樣品中原花青素含量的測定

將黑果枸杞粉碎后過0.25 mm孔徑篩，準(zhǔn)確稱取2.0 g黑果枸杞粉末，按設(shè)定的料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在設(shè)定的功率下進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎提取，提取結(jié)束后，離心收集上清液并定容至一定體積（視情況而定），移取1 mL提取液替代上述方法中的標(biāo)準(zhǔn)液測定吸光度，重復(fù)測定3次，按式（1）計算樣品中原花青素得率[15]。

式中：N為稀釋倍數(shù)；C為粗提液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；m為黑果枸杞的質(zhì)量，g；V為粗提液定容后的體積，mL。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

稱取2.0 g黑果枸杞粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇水溶液，在超聲功率為200 W、超聲開/關(guān)時間為50 s/10 s的條件下超聲25 min，測定黑果枸杞原花青素的得率。固定其他反應(yīng)條件，分別考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%，40%，50%，60%，70%和80%）、超聲時間（10，15，20，25，30和35 min）、超聲功率（100，200，300，400，500和600 W）對原花青素得率的影響。

1.3.3 Box-Behnken試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以原花青素得率作為響應(yīng)值，對超聲時間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）、超聲功率（D）進(jìn)行條件優(yōu)化，每個因素選取3個最靠近原花青素得率最大處的水平，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化超聲細(xì)胞破碎法提取原花青素的工藝。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表

1.3.4 黑果枸杞原花青素抗氧化活性研究

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

黑果枸杞原花青素DPPH自由基清除活性的測定參照Shimada等[16]的方法。先配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，然后分別將2.5 mL質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25和30 μg/mL的原花青素樣液和2.5 mL DPPH乙醇溶液混合，室溫避光反應(yīng)20 min后，在517 nm處測溶液吸光度A1，然后以2.5 mL 95%的乙醇代替DPPH乙醇溶液測得吸光度A2，再以2.5 mL蒸餾水代替樣液測得吸光度A3。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為2.5 mL原花青素樣品溶液+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為2.5 mL原花青素樣品溶液+2.5 mL 95%乙醇的吸光度；A3為2.5 mL蒸餾水+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.3.4.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力的測定參考Ozkan等[17]的方法。在比色管中依次加入1.0 mL H2SO4溶液（3.0 mol/L）、1.0 mL Na3PO4溶液（0.14 mol/L）和1.0 mL鉬酸銨溶液（0.02 mol/L），再加入1.0 mL質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的原花青素樣液，用蒸餾水定容至5.0 mL，充分搖勻，在95 ℃的水浴中加熱90 min，取出冷卻后在波長695 nm下測定吸光度，以VC作陽性對照，以蒸餾水代替樣液作空白，吸光度越大說明樣品的總抗氧化能力越強。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2018軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用Origin 8.0制作圖表，采用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗的設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果及分析

2.1.1 料液比對原花青素得率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比增大時，原花青素得率也逐漸升高，這是因為隨著料液比的增大，提供給原花青素析出的空間增大，原花青素的得率也逐漸升高；一定質(zhì)量的黑果枸杞含有原花青素的量是一定的，因此當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時得率達(dá)到最大值[18]。為了降低成本、減少溶劑的浪費及縮短后繼減壓蒸餾步驟的時間，提取的最佳料液比選擇1∶30（g/mL）。

圖1 料液比對原花青素得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率的影響

如圖2所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，溶劑對細(xì)胞壁的穿透作用增大，對氫鍵的破壞能力增強，原花青素的得率也逐漸升高。通過調(diào)節(jié)乙醇-水配比改變?nèi)芤簶O性，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，溶劑極性與原花青素極性相當(dāng)，利于原花青素的析出，得率達(dá)到最大值[19]。當(dāng)繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)時，脂溶性雜質(zhì)大量析出，與原花青素競爭與乙醇-水分子的結(jié)合，使原花青素得率下降。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇50%。

由于委派制在某種程度上的“過渡性”和“不徹底性”，審計人員的專業(yè)化、系統(tǒng)化的培訓(xùn)較少，人員專業(yè)素養(yǎng)提升較慢，難以勝任日益復(fù)雜的審計業(yè)務(wù)要求。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率得影響

2.1.3 超聲時間對原花青素得率的影響

從圖3可以看出，原花青素的得率隨超聲時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在25 min達(dá)到最大值。原因在于：超聲時間不足會造成原花青素的提取不夠充分，原花青素未能充分析出；超聲時間過長則會使提取液溫度逐漸上升，長時間的過高溫度會破壞原花青素的酚羥基結(jié)構(gòu)，還會增加其他雜質(zhì)的溶出，進(jìn)而導(dǎo)致原花青素的得率降低[20]。因此超聲破碎時間選擇25 min。

圖3 超聲時間對原花青素得率的影響

2.1.4 超聲功率對原花青素得率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，原花青素得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在超聲功率為200 W時得率最大，之后隨著功率的增加得率逐漸降低。超聲產(chǎn)生的強烈攪拌振蕩作用和空化效應(yīng)利于料液間的充分接觸，加速細(xì)胞破碎，進(jìn)而促使胞內(nèi)有效成分溶出。但超聲破碎功率增大到一定程度后，提取液會出現(xiàn)空化泡，減少能量的傳遞，不利于原花青素提取。當(dāng)超聲功率過大時，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機械作用過強，導(dǎo)致原花青素發(fā)生降解，使得率降低[21]。因此，超聲細(xì)胞破碎的功率選擇200 W。

圖4 超聲功率對原花青素得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計的結(jié)果及分析

2.2.1 模型的建立及數(shù)據(jù)分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以原花青素得率為響應(yīng)值，選取超聲時間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、料液比（C）、超聲功率（D）為影響因素，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。對其進(jìn)行多元回歸分析，得到預(yù)測模型：Y=6.12+0.16A-0.043B-0.084C+0.21D+0.093AB+0.05AC-0.12AD-0.03BC-0.16BD-0.042CD-0.32A2-0.34B2-0.26C2-0.5D2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗，由表3方差分析表可知：模型的p值＜0.000 1，差異極顯著（p＜0.01），說明該回歸模型是有效可靠的，有較好的統(tǒng)計學(xué)意義；模型的失擬項p=0.143 8＞0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程的擬合度高，其他外來因素對試驗結(jié)果的影響較?。幌嚓P(guān)系數(shù)R2=0.932 1，Radj2=0.864 2，說明該模型能預(yù)測85%以上的響應(yīng)值的變化，預(yù)測值與真實值有較高的相關(guān)性，可以用該模型對黑果枸杞原花青素的提取工藝進(jìn)行預(yù)測。

表3 方差分析表

根據(jù)F檢驗可得：回歸方程的一次項A，D極顯著，C顯著（p＜0.05），各因素對原花青素得率的影響由大到小排列為D＞A＞C＞B，即超聲功率＞超聲時間＞料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)；交互項只有BD顯著，說明只有乙醇體積分?jǐn)?shù)及超聲功率對原花青素得率有明顯的交互作用；二次項A2、B2、C2、D2均影響極顯著，表明各因素對響應(yīng)值并非簡單的線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖可以直觀反映超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲功率對原花青素得率的影響。如圖5所示：超聲功率對黑果枸杞原花青素得率的影響最大，表現(xiàn)在圖上的響應(yīng)曲面沿著超聲功率的方向的坡度較大、較陡，超聲時間及料液比次之；乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響不顯著，表現(xiàn)在圖上的坡度較平緩。響應(yīng)曲面坡度陡峭則表示兩因素間交互作用強，如圖中的超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用顯著，而其余各因素的響應(yīng)面坡度較小，表明其交互作用不顯著，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素對原花青素得率影響的響應(yīng)面曲線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗證

利用Design-Expert 8.0軟件，分析得出超聲細(xì)胞破碎法提取黑果枸杞原花青素的最佳提取工藝：超聲時間25.95 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.21%、料液比1∶29.22（g/mL）、超聲功率220.25 W。在此條件下，原花青素得率為6.17%；為方便實際操作，將試驗條件定為超聲時間26 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶29（g/mL）、超聲功率220 W。在調(diào)整后的工藝條件下做3次重復(fù)試驗驗證，得到的黑果枸杞原花青素得率分別為6.14%，6.07%和6.11%，平均得率為6.107%，與預(yù)測值的相對誤差為1.02%，重復(fù)性較好，工藝可靠，具有一定的實用價值。

2.3 黑果枸杞原花青素抗氧化活性的研究

2.3.1 DPPH自由基清除活性

如圖6所示：隨著黑果枸杞原花青素質(zhì)量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸升高，在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，原花青素對DPPH自由基的清除率接近100%；與黑果枸杞原花青素相比，VC對DPPH自由基有較強的清除作用，在20 μg/mL時就基本可以將DPPH自由基完全清除；兩者在較低濃度時對DPPH自由基有較強的清除作用，對DPPH自由基的清除用作呈現(xiàn)濃度依賴性，在高于25 μg/mL時，兩者對DPPH自由基的清除作用相當(dāng)，說明黑果枸杞原花青素?fù)碛休^強的DPPH自由基清除能力。

圖6 黑果枸杞原花青素對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 總抗氧化能力

由圖7可以看出：黑果枸杞原花青素和VC的總抗氧化能力呈現(xiàn)濃度依賴性，質(zhì)量濃度越大，總抗氧化能力越強；在低濃度時，原花青素的總抗氧化能力高于VC；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.06 mg/mL時，總抗氧化能力略低于VC，說明黑果枸杞原花青素具有較強的抗氧化能力。

圖7 黑果枸杞原花青素的總抗氧化能力

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲細(xì)胞破碎提取黑果枸杞中原花青素的工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，研究單個因素間及其交互作用對原花青素得率的影響，得到的優(yōu)化工藝條件為超聲時間26 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶29（g/mL）、超聲功率220 W。在此條件下，原花青素的得率為6.10%±0.03%，與預(yù)測值6.17%相比，相對誤差為1.02%，說明該回歸模型的擬合度較好，對優(yōu)化黑果枸杞原花青素的提取工藝有指導(dǎo)意義。同時體外抗氧化試驗表明，黑果枸杞原花青素在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率能達(dá)到97%，總抗氧化能力與VC相當(dāng)，說明黑果枸杞原花青素具有較強的自由基清除活性和抗氧化活性。