不同發(fā)酵條件對歐李酒多酚含量及苦味的影響

李姝琪，郭曉夢，張惠玲*

寧夏回族自治區(qū)寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室（銀川 750021）

歐李為薔薇科櫻屬的灌木，是中國獨有的果樹品種[1]。歐李果實中富含多酚物質(zhì)及多種糖酸[2]、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有顯著的保健功能[3]。歐李果酒是指以歐李果實為原料，經(jīng)過發(fā)酵釀造而得的果酒，其酒體呈寶石紅，酒香濃郁，酒體醇厚，余味綿長，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)[4]。歐李酒中的多酚物質(zhì)是歐李酒中的重要組成成分，是歐李酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，對酒的品質(zhì)起著重要作用[5]，多酚物質(zhì)的濃度超過其閾值時，酒就會產(chǎn)生其特有的苦澀味。兒茶素、表兒茶素、諾米林等多酚物質(zhì)主要賦予歐李酒的苦味，單寧對苦澀味也有貢獻(xiàn)，但濃度都不能太高，不然會使酒的苦澀味變重，影響酒的風(fēng)味和口感[6]。

現(xiàn)階段，歐李主要用于制作果干、果脯和果汁等食品，研發(fā)產(chǎn)品過于單調(diào)，應(yīng)用范圍窄。隨著歐李果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們對歐李果酒的釀造工藝研究較多，但是對不同發(fā)酵條件影響多酚物質(zhì)含量以及對歐李酒苦澀味的影響，報道很少。試驗對歐李品種4號進行釀造，通過測定不同發(fā)酵條件下歐李酒中多酚含量，了解不同發(fā)酵條件對歐李酒多酚含量以及苦味的影響，選出最優(yōu)發(fā)酵條件，為歐李酒發(fā)酵工藝的改進和低苦歐李酒的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

農(nóng)大歐李4號，來自寧夏中衛(wèi)；釀酒活性干酵母Excellence XR，法國Lamothe-Abiet公司。甲醇、原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸、檸檬苦素、柚皮素、諾米林、綠原酸，均為色譜純，純度≥99%，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；福林試劑、沒食子酸，均為分析純，麥克林公司；領(lǐng)苯二酚、2, 6-二氯酚靛酚、3,5-二硝基水楊酸、乙酸乙酯、VC、NaCl，均為分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

7089B-5977B HPLC-MS聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；DF-Ⅱ數(shù)顯集熱式磁力攪拌器（常州愛華儀器制造有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣

在寧夏中衛(wèi)，采取不同成熟度的農(nóng)大歐李4號果實，于果實轉(zhuǎn)色期開始進行取樣至成熟期，取樣方法為從歐李枝的不同方位采樣，混勻、去核、取汁。原料采摘時以可溶性固形物含量表示成熟度，如表1所示。

表1 果實成熟度

1.2.2 工藝流程

新鮮歐李→清洗→去核打漿→酶解→成分調(diào)整→加入SO2→接種酵母→主發(fā)酵→過濾→后酵→澄清→罐裝→成品

1.2.3 操作要點

酵母活化：稱取0.2 g/L活性釀酒酵母，于37 ℃水浴活化15 min，備用[7]。

去核打漿：分別選擇無蟲、無腐爛的不同成熟度的歐李原料，用脫核打漿機進行打漿待用。

原料預(yù)處理：取3個不同成熟度的歐李漿，料水比1∶2 g/L，向歐李發(fā)酵液中分別加入0.06 g/L蛋白酶和0.5 g/L果膠酶，于45 ℃酶解6 h。用白砂糖調(diào)整節(jié)糖度至23 °Bx。pH 3.3，按60 mg/L加入6%的亞硫酸溶液[8]。

1.2.4 不同成熟度歐李發(fā)酵

確定酵母接種量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L、發(fā)酵溫度20 ℃，選用七成熟、八成熟、完熟的3個不同成熟度的歐李進行發(fā)酵，當(dāng)酒精度不再發(fā)生變化時，主發(fā)酵結(jié)束，去除沉淀，澄清過濾，取樣測定。

1.2.5 歐李發(fā)酵工藝優(yōu)化

1) 初糖確定：試驗定位產(chǎn)品酒精度12%vol～13%vol，因此確定發(fā)酵初始糖度23 °Bx。試驗用白砂糖進行調(diào)整。

2) 不同料水比確定：取歐李漿添加不同量的水，使料水比為1∶1，1∶2，1∶3和1∶4 g/L，在初糖22%、發(fā)酵溫度20 ℃、酵母接種量0.2 g/L、pH 3.3的條件下進行發(fā)酵，當(dāng)酒精度不再發(fā)生變化時，主發(fā)酵結(jié)束，皮渣分離，澄清過濾，取樣測定。

3) 不同發(fā)酵溫度確定：確定酵母接種量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L、pH 3.3，設(shè)置不同溫度（15，20，25，30和35 ℃）進行發(fā)酵，當(dāng)酒精度不再發(fā)生變化時，主發(fā)酵結(jié)束，除酒渣，取樣測定。

4) 不同接種量確定：確定發(fā)酵溫度20 ℃、料水比1∶2 g/L、pH 3.3，設(shè)置不同酵母接種量（0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 g/L）進行發(fā)酵，當(dāng)酒精度不再發(fā)生變化時，主發(fā)酵結(jié)束，除酒渣，澄清過濾，取樣測定。

1.2.6 檢測方法

單寧、總酚、單體酚含量的測定：采用HPLC-MC法進行測定。

樣品前處理：用20 mL乙酸乙酯分別萃取20 mL酒樣3次，合并有機相后減壓蒸餾濃縮至干（＜37 ℃），以4 mL色譜甲醇溶解殘渣，于-30 ℃左右避光儲存，待液相檢測分析，在分析測定前需使用0.45 μm有機微孔濾膜過濾處理后的樣品[9]。

標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：精密稱取適量沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、柚皮素、諾米林、檸檬苦素、綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜醇甲醇，制得1.0 mg/mL的單標(biāo)對照品溶液，備用，同時制備混標(biāo)對照品溶液。

HPLC-MS色譜條件：C18（1.8 μm×100 mm×2.1 mm）色譜柱；流動相：流動相A甲醇、流動相B 0.1%甲酸水。梯度洗脫，梯度洗脫條件：0～4 min，甲醇-水（90∶10，V/V）；4～8 min，甲醇-水（80∶20，V/V）；8～12 min，甲醇-水（75∶25，V/V）；12～14 min，甲醇-水（63∶36，V/V）；14～14.6 min，甲醇-水（50∶50，V/V）；14.6～17.6 min，甲醇-水（5∶95，V/V）；17.6～18.2 min，甲醇-水（5∶95，V/V）；18.2～20 min，甲醇-水（90∶10，V/V）勻速梯度至甲醇-水（90∶10，V/V）。流速：0.8 mL/min；檢測波長：270和370 nm；柱溫30 ℃；進樣量：10 μL[10]。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正電子電離方式ESI+；離子源溫度：200 ℃；霧化氣體流速：1.5 L/min；脫溶溫度：200 ℃；掃描范圍：m/z100～1 000；掃描時間：30 min。

表2 5種單體酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線的回歸方程

苦味評分：參照中藥湯劑苦味研究[11]，對歐李酒苦味進行感官品評?？辔镀吩u小組由接受過專業(yè)感官訓(xùn)練的12名學(xué)生和老師組成（男6名，女6名）。酒樣被隨機編號，對歐李酒進行品嘗比較，將評分表的品嘗結(jié)果均一化，并通過條形圖表示結(jié)果。

表3 苦味評價標(biāo)準(zhǔn)

數(shù)據(jù)分析方法：所有試驗平行測定3次，用M±SD表示，采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Origin、Excel進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李酒發(fā)酵前后酚類物質(zhì)含量變化

如表4所示，酒精發(fā)酵結(jié)束后的歐李新酒中，各個單體酚發(fā)生了含量的變化。新酒中沒食子酸含量較歐李果實降低0.22倍，較柚皮素降低0.66倍，較咖啡酸降低0.74倍，較楊梅素降低0.27倍。而新酒中的單寧增加幅度最大，表兒茶素含量較歐李果實增加0.15倍，較諾米林增加0.42倍，這是由于發(fā)酵可能促進植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致游離酚類化合物含量增加[12]。在發(fā)酵過程中高分子量酚類可被多酚氧化酶解聚[13]，使單體酚從聚合物中游離出來。此外，某些發(fā)酵產(chǎn)物會導(dǎo)致不同單體酚之間相互轉(zhuǎn)化[14]，發(fā)酵過程中兒茶素含量變化相對穩(wěn)定，可能與其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。酒精發(fā)酵過程中，不同單體酚之間相互轉(zhuǎn)化、解聚[15]，導(dǎo)致其含量降低，所以新酒較發(fā)酵前苦味相對降低，口感純正，整體平衡性好。

表4 歐李酒發(fā)酵前后酚類物質(zhì)含量變化比較 單位：mg/L

2.2 發(fā)酵工藝對歐李酒多酚含量及苦味影響

2.2.1 歐李原料成熟度對歐李酒多酚含量及苦味影響由圖1和表5可知，隨著果實成熟度增加，釀造的歐李酒中多酚含量逐漸上升，苦味評分隨之增大，直到完全熟時達(dá)到最大值，黃酮、沒食子酸、兒茶素和表兒茶素含量增加幅度較大，單寧、柚皮素、咖啡酸、檸檬苦素、諾米林和楊梅素增加幅度較小，但含量均在逐漸上升。通過品嘗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)八成熟R-2時，歐李酒苦味最輕，口感純正，整體平衡性好，苦味評分最低，因為在七分熟時，歐李果實糖含量低，在八成熟時，隨著成熟度的增加，歐李果實在成熟期間會積累糖，含糖量上升，但多酚含量上升幅度不是很大。在歐李果實完熟時，雖然過熟的歐李果實含糖量高，酸甜可口，但是后味有苦，特別是皮中的苦比較明顯，主要原因是酚類物質(zhì)等活性成分含量較高，這些物質(zhì)集中在皮中，所以釀造的歐李酒苦澀味較重，不適宜飲用。因此，選用八成熟的歐李果實來釀酒較適宜，苦味輕，整體風(fēng)味好。

圖1 不同成熟度發(fā)酵的歐李酒的苦味評分

表5 不同成熟度發(fā)酵的歐李酒多酚含量比較 單位：mg/L

2.2.2 料水比對歐李酒多酚含量及苦味影響

由圖2和表6可知，隨著加水比變化，多酚含量相應(yīng)地變化，苦味評分也隨之變化。不加水發(fā)酵的歐李酒中單寧、沒食子酸、柚皮素、諾米林含量較料水比1∶1 g/L發(fā)酵的歐李酒低，這是因為一旦加水少或不加水時，制得的歐李汁相對較濃稠，進而發(fā)酵受到影響，同樣會影響單寧等酚類物質(zhì)的溶出。隨著加水比增大，單寧、黃酮和沒食子酸等10種酚類物質(zhì)在酒中的含量降低，說明水量增多，酚類物質(zhì)濃度會降低，酒體的苦味也隨之變輕。因此，選擇料水比1∶2 g/L釀酒較適宜，不影響發(fā)酵且苦味較輕。

圖2 不同料水比發(fā)酵的歐李酒的苦味評分

表6 不同料水比發(fā)酵的歐李酒多酚含量比較 單位：mg/L

2.2.3 發(fā)酵溫度對歐李酒多酚含量及苦味影響

由圖3和表7可知，隨著發(fā)酵溫度變化，歐李酒中多酚含量相應(yīng)地變化，苦味評分也隨之變化。當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時，歐李酒中多酚含量最高，苦味評分最高，原因是高溫發(fā)酵加劇了對劣質(zhì)單寧的萃取[16]，使得單寧和黃酮含量增加。其他酚類物質(zhì)均有相似的變化趨勢。原因是隨著發(fā)酵溫度升高，酶解和發(fā)酵可能促進植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致游離酚類化合物含量增加[17]，使酒體苦澀味加重。當(dāng)發(fā)酵溫度在20～25 ℃時，苦味評分最低，因為低溫發(fā)酵，單寧、黃酮等多酚含量較低，苦澀味輕并且可以保留較多的果香，口感質(zhì)量好，因此采用20 ℃低溫發(fā)酵最佳，以保留較多果香，減少對劣質(zhì)單寧的萃取。

圖3 不同發(fā)酵溫度的歐李酒的苦味評分

表7 不同發(fā)酵溫度的歐李酒多酚含量比較 單位：mg/L

2.2.4 接種量對歐李酒多酚含量及苦味的影響

由圖4和表8可知，在相同的溫度條件下發(fā)酵，酵母添加量對歐李酒中多酚含量有一定的影響，苦味評分隨著接種量的增加而逐漸升高。這主要是因為隨著接種量的增加，發(fā)酵速度也加快，原料中的一些物質(zhì)不斷被溶出，游離的酚類化合物含量增加[18]。同時黃酮、沒食子酸、兒茶素和諾米林等多酚含量均有增加，當(dāng)含量超過其閾值時，會使酒的苦澀味加重，同時酵母自身帶有較多的酸性蛋白酶和酸性羧肽酶，在發(fā)酵后期菌體自溶產(chǎn)生生物胺等活性成分，會增加酒體的后苦味[19]，并且隨著接種量的增加，發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵速度加快，使得酵母菌代謝產(chǎn)物中不利的物質(zhì)增多，酒體粗糙，產(chǎn)生較多的高級醇，也增加酒體的苦味，進而影響酒的品質(zhì)和整體平衡性。因此，綜合考慮選取0.2 g/L為最佳接種量。

表8 不同酵母接種量的歐李酒多酚含量比較 單位：mg/L

圖4 不同酵母接種量的歐李酒的苦味評分

3 結(jié)論

試驗研究了不同成熟度、發(fā)酵溫度、酵母接種量和料水比對歐李酒多酚含量及苦味影響。原料成熟度越大，歐李果皮中的多酚含量就越高，所釀的歐李酒雖然香氣質(zhì)量高，但苦澀味重，口感差。高溫發(fā)酵以及酵母菌接種量大，均會加快發(fā)酵速度，高溫發(fā)酵加速了對劣質(zhì)單寧的萃取，同時促進了植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致單寧、黃酮等多酚物質(zhì)含量增加，增加了酒體的苦味。酵母接種量大，發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵速度加快，使原料中一些物質(zhì)不斷被溶出，游離的酚類化合物含量增加，同時黃酮、兒茶素、表兒茶素等多酚物質(zhì)含量也在增加，當(dāng)濃度超過其閾值時，會導(dǎo)致酒苦澀味加重，從而影響酒的品質(zhì)。料水比過低，制得的歐李汁較濃稠，發(fā)酵受到影響，同樣會影響單寧等多酚物質(zhì)的溶出。加水比例過大，發(fā)酵酒體單薄口感不好。因此，八成熟、發(fā)酵溫度20 ℃、酵母接種量0.2 g/L、料水比1∶2 g/L的發(fā)酵工藝苦味較輕，酒的品質(zhì)和整體平衡性最佳。