MCU在低氧誘導(dǎo)肉雞心肌細(xì)胞線粒體損傷中的作用

龐聰穎，喬 娜，陳漢明，馬欣艷，張 輝，潘家強(qiáng)，唐兆新，李 英

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

肉雞肺動(dòng)高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)是由低溫、缺氧、生長(zhǎng)過(guò)快、遺傳等多種因素單一或者共同作用下誘導(dǎo)的肉雞非傳染性營(yíng)養(yǎng)代謝病，常見(jiàn)于生長(zhǎng)較快的肉仔雞?，F(xiàn)代快速生長(zhǎng)的肉禽品種對(duì)心力衰竭非常敏感，右心肥大衰竭是PHS肉雞死亡的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PHS肉雞心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，心肌細(xì)胞發(fā)生水腫和肥大，顆粒變性、空泡變性甚至壞死[2-4]。心肌細(xì)胞Ca2+濃度增加導(dǎo)致細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)鈣緩沖器，能吸收細(xì)胞內(nèi)增加的Ca2+，調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)[5]。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)是位于線粒體內(nèi)膜上的跨膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+進(jìn)入線粒體基質(zhì)。MCU過(guò)表達(dá)可使線粒體內(nèi)Ca2+濃度增加；MCU沉默使線粒體Ca2+濃度的增加被抑制[6]。其活性受到線粒體鈣攝取蛋白1(mitochondrial calcium uniporter 1，MICU1)的調(diào)節(jié)。MICU1作為MCU的門控蛋白，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中Ca2 +濃度較低時(shí)，MICU1保持MCU處于關(guān)閉狀態(tài)，可減少胞漿中的Ca2+進(jìn)入線粒體[7]。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度較高時(shí)，MICU1作為MCU通道的協(xié)同激活劑，通過(guò)增加MCU的打開(kāi)概率，增加激動(dòng)劑誘發(fā)的線粒體Ca2 +濃度增加。線粒體鈣單一轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)劑1(mitochondrial cal-cium uniporter regulator 1，MCUR1)作為MCU的正調(diào)控因子，當(dāng)其沉默時(shí)能抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的線粒體Ca2+攝取，并導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中Ca2+濃度顯著減少[8]。

心臟的收縮受心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存和釋放過(guò)程調(diào)節(jié)[6]，細(xì)胞內(nèi)80%的Ca2+儲(chǔ)存于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。線粒體基質(zhì)中有大量Ca2+，線粒體產(chǎn)能的過(guò)程與線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程息息相關(guān)。線粒體內(nèi)Ca2+生理性的增加可激活線粒體脫氫酶，加速氧化代謝，促進(jìn)ATP生成。但是，線粒體鈣超載導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開(kāi)放，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體去極化，膜電位下降和線粒體碎片化[9-10]。當(dāng)細(xì)胞受損或受到刺激時(shí)，常伴有細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高[11]。過(guò)量游離Ca2+導(dǎo)致的鈣超載對(duì)細(xì)胞具有損傷作用，會(huì)引起細(xì)胞腫脹破裂，以及通過(guò)凋亡、自噬、壞死等路徑的細(xì)胞死亡[9]。線粒體作為細(xì)胞Ca2+超載的重要緩沖器，在細(xì)胞Ca2+超載中發(fā)揮著重要作用。RU360是一種細(xì)胞滲透性氧橋聯(lián)雙核釕胺絡(luò)合物，作用于MCU，特異性阻斷線粒體Ca2+攝取。線粒體通過(guò)MCU轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+進(jìn)入線粒體基質(zhì)，但MCU介導(dǎo)線粒體鈣轉(zhuǎn)運(yùn)是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞線粒體損傷尚不明確。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)不同時(shí)間低氧處理肉雞心肌細(xì)胞，并使用RU360抑制MCU的表達(dá)，探究MCU是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞線粒體損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

817白羽肉雞雞胚購(gòu)于山東德州忠言肉雞場(chǎng)，進(jìn)行常規(guī)消毒和處理后，置于旋轉(zhuǎn)孵化箱中37.9 ℃和70%濕度條件下孵化至12胚齡。

1.2 主要試劑和儀器

活性氧試劑盒(S0033)購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；膜電位試劑盒(C2006)、Ripa裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自上海天能技術(shù)有限公司；F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清購(gòu)自Gibco有限公司，F(xiàn)luo-4，Rhod-2，MCU(#14997)，MICU1(#12524)，MCUR1(#13706)抗體(動(dòng)物來(lái)源：兔)均購(gòu)自CST公司；TRIzol RNA提取試劑，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；β-actin 抗體，購(gòu)自北京銳抗生物技術(shù)有限公司；Prime Script Master Mix、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司公司。α-橫紋肌動(dòng)蛋白(alpha sarcomeric Actin)單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；RU360，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

微量核酸測(cè)定儀購(gòu)自Thermo Fisher科技公司；TDZ5-DZ5型冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；My Cycler Thermal型 mRNA擴(kuò)增儀、Light Cycler408型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Unique-R10型超純水儀購(gòu)自廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；GelView 6000 Pro全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自廣州博鷺騰儀器儀表有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼爾特有限公司。

1.3 雞原代心肌細(xì)胞提取培養(yǎng)與低氧處理

參照張曉輝[12]的方法進(jìn)行，略作改動(dòng)。試驗(yàn)中所用器械、耗材等均經(jīng)過(guò)121 ℃、30 min高壓滅菌，操作過(guò)程中避免細(xì)菌污染。將孵化至12日齡的雞胚無(wú)菌操作取出心，浸泡于4 ℃預(yù)冷的PBS中。以相同操作取出其余雞胚的心。將心周圍多余脂肪和相連的血管去除，清除心組織內(nèi)的血液。將心組織剪碎，加入足量預(yù)熱的0.12%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴鍋中輕微震蕩消化8 min，加入等量含10% FBS培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，收集消化液。多次消化至心組織呈絮狀，用200目和400目細(xì)胞篩分別濾過(guò)消化液。消化液差速離心，重懸后心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁30 min左右(利用成纖維細(xì)胞最先貼壁的特性，將心肌組織中的成纖維細(xì)胞去除)。收集差異貼壁后的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)肉雞心肌細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至試驗(yàn)需要。接種于細(xì)胞板，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為對(duì)照組(C)和試驗(yàn)組(T)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)條件37 ℃、21%O2；試驗(yàn)組利用培養(yǎng)小室做低氧處理，培養(yǎng)條件為37 ℃、3%O2，處理時(shí)間分別為24、48和72 h，做心肌細(xì)胞損傷造模。在低氧培養(yǎng)72 h添加RU360預(yù)處理組，抑制MCU表達(dá)，進(jìn)一步明確MCU是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細(xì)胞線粒體損傷。

1.4 心肌細(xì)胞鑒定

將細(xì)胞爬片置于24孔板孔內(nèi)，接種肉雞心肌細(xì)胞。生長(zhǎng)穩(wěn)定后，先用PBS洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞；0.2% Triton-100細(xì)胞打孔；3% H2O2處理15 min；10%馬血清，37 ℃，封閉1 h；加入α-SA抗體，4 ℃，過(guò)夜；1%BSA配制單抗鼠IgG，室溫反應(yīng)40 min；DAB染色2 min，用PBS終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染5 min，鹽酸分色3 s，氨水反藍(lán)5 min，干燥，中性樹(shù)脂封片，鏡檢。操作同任昊[13]和秦士貞[14]的方法。

1.5 ROS和膜電位測(cè)定

收集不同低氧時(shí)間處理的細(xì)胞，細(xì)胞染色和孵育具體操作詳見(jiàn)ROS和膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。染色結(jié)束后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞和線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化的測(cè)定

Fluo-4 AM探針是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的濃度。Fluo-4 AM在細(xì)胞外時(shí)幾乎不發(fā)光，當(dāng)Fluo-4 AM進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)的酶剪切形成Fluo-4而滯留于細(xì)胞內(nèi)。Fluo-4可以和Ca2+結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)熒光，其信號(hào)強(qiáng)度與Ca2+濃度呈正相關(guān)。Rhod-2探針在結(jié)合Ca2+前基本不發(fā)熒光，熒光信號(hào)與Ca2+結(jié)合后明顯增強(qiáng)。其激發(fā)和發(fā)射光譜不會(huì)隨著細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+變化發(fā)生明顯的遷移，其特異性適合檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)線粒體的Ca2+水平，其信號(hào)強(qiáng)度與Ca2+濃度呈正相關(guān)。將低氧處理24、48和72 h的細(xì)胞用預(yù)熱HBSS清洗3次后，依照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色操作，注意染液的配置和染色后細(xì)胞的洗滌均使用HBSS緩沖液。

1.7 qRT-PCR分析

qRT-PCR檢測(cè)MCU、MICU1和MCUR1的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。按照諾唯贊試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。使用Thermo Fisher科技公司的微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的總濃度和純度。內(nèi)參 mRNA為β-actin。使用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。

表1 qRT-PCR使用的引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.8 Western blot分析

將不同低氧時(shí)間處理的細(xì)胞用含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液消化，提取總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，將每個(gè)樣品稀釋至同一濃度，依照說(shuō)明書(shū)操作，制備蛋白檢測(cè)樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。等量的總蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)12.5%SDS-PAGE分離膠分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液常溫?fù)u床封閉1 h，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜。二抗孵育1 h，使用ECL發(fā)光液顯影，使用GelView6000 Pro全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行分組方差分析比較，采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞的驗(yàn)證

α-SA能標(biāo)記心肌肌動(dòng)蛋白，心肌細(xì)胞與α-SA發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，表達(dá)呈陽(yáng)性。免疫組化染色后，可見(jiàn)圖1A是用PBS代替一抗的陰性對(duì)照，細(xì)胞胞漿未見(jiàn)棕黃色；圖1B的心肌細(xì)胞呈明顯的陽(yáng)性著色，胞漿為棕黃色，細(xì)胞核接近圓形，心肌細(xì)胞呈三角形、梭形和不規(guī)則星形。非心肌細(xì)胞α-SA抗原表達(dá)為陰性，不會(huì)出現(xiàn)上述反應(yīng)，由此可以鑒定為心肌細(xì)胞。參照前人的方法[15]，隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)(心肌細(xì)胞純度=心肌細(xì)胞數(shù)/該視野細(xì)胞總數(shù)*100%)，心肌細(xì)胞純度約為93%。

A.對(duì)照處理;B.陽(yáng)性結(jié)果A.Control treatment;B.Positive result圖1 免疫組化染色細(xì)胞爬片(400×)Fig.1 Immunohistochemical staining cell slide (400×)

2.2 線粒體功能狀態(tài)評(píng)價(jià)

由圖2可知，低氧處理24 h，試驗(yàn)組線粒體膜電位上升，差異顯著(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比ROS的產(chǎn)生增加，線粒體膜電位下降，差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明線粒體發(fā)生損傷；低氧處理72 h時(shí)，RU360預(yù)處理組與試驗(yàn)組相比，在RU360抑制MCU活性后，ROS的產(chǎn)生減少，線粒體膜電位上升，差異極顯著(P<0.01)。

A.DCF探針熒光強(qiáng)度分析，反映ROS產(chǎn)生的變化；B.JC-1探針熒光強(qiáng)度分析，反映線粒體膜電位變化A.Fluorescence intensity analysis of DCF probe,reflecting the changes of ROS production;B.Fluorescence intensity analysis of JC-1 probe,reflecting the changes of mitochondrial membrane potential圖2 線粒體功能評(píng)價(jià)Fig.2 Evaluation of mitochondrial function

2.3 細(xì)胞和線粒體鈣離子濃度變化

由圖3可知，低氧處理24和48 h，試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增多，差異顯著(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增多，差異極顯著(P<0.01)，低氧處理72 h時(shí)，RU360預(yù)處理組與試驗(yàn)組相比，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+減少，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，抑制MCU的活性能減輕低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多。

a、b、c.分別常氧培養(yǎng)24、48、72 h的心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖;d、e、f.分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖；g.低氧培養(yǎng)72 h且RU360預(yù)處理的心肌細(xì)胞線粒內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖；h.細(xì)胞內(nèi)Fluo-4探針熒光強(qiáng)度分析a,b and c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in the linemere of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of intracellular Fluo-4 probe圖3 心肌細(xì)胞鈣離子濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Determination results of calcium ion concentration in cardiomyocytes

由圖4可知，低氧處理24和72 h，試驗(yàn)組線粒體內(nèi)游離Ca2+增多，差異顯著(P<0.05)，低氧處理72 h時(shí)，RU360預(yù)處理組與試驗(yàn)組相比，線粒體內(nèi)游離Ca2+減少，差異極顯著(P<0.01)。說(shuō)明低氧誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+濃度增加，抑制MCU活性能減輕低氧誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)Ca2+增多。

a、b、c.分別為常氧培養(yǎng)24、48、72 h的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖;d、e、f.分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖；g.低氧培養(yǎng)72 h且RU360預(yù)處理的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細(xì)胞儀分析圖；h.線粒體內(nèi)Rhod-2探針熒光強(qiáng)度分析a,b,c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of Rhod-2 probe in mitochondria圖4 線粒體鈣離子濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Calcium ion concentration detection result

2.4 MCU、MICU1、MCUR1 mRNA與蛋白表達(dá)水平

由圖5可知，低氧處理24 h，試驗(yàn)組MCU、MICU1 mRNA的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；低氧處理48 h，試驗(yàn)組MCUR1和MICU1 mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗(yàn)組MCUmRNA的表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)。低氧72 h且RU360預(yù)處理組與低氧72 h組相比，MCUmRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

圖5 低氧處理心肌細(xì)胞MCU、MICU1、MCUR1 mRNA表達(dá)量Fig.5 mRNA expression levels of MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

由圖6可知，低氧處理24 h，試驗(yàn)組MCU和MICU1蛋白的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，差異不顯著(P>0.05)，MCUR1蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，差異不顯著(P>0.05)；低氧處理48 h，試驗(yàn)組MCU和MICU1蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，差異不顯著(P>0.05)，MCUR1蛋白表達(dá)下調(diào)，差異顯著(P<0.01)；低氧處理72 h，試驗(yàn)組MCU和MICU1蛋白表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，MCUR1蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，都差異不顯著(P>0.05)。

圖6 低氧處理心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCU、MICU1、MCUR1相對(duì)表達(dá)Fig.6 Relative expression of calcium transporter MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

3 討 論

肉雞肺動(dòng)脈高壓常見(jiàn)于生長(zhǎng)迅速的肉雞，因其體型生長(zhǎng)過(guò)快，導(dǎo)致臟器的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)法滿足機(jī)體的消耗；機(jī)體代謝功能紊亂、Ca2+釋放增加、心肌細(xì)胞發(fā)生肥大及纖維化；心組織變形、腫大、質(zhì)地變?nèi)彳?；右心肥大擴(kuò)張發(fā)生衰竭[3,16]。Ca2+刺激線粒體產(chǎn)生能量促進(jìn)心收縮，也可觸發(fā)細(xì)胞死亡[17-18]。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+參與不同酶系和各種類型細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)。細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放是細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加的主要途徑。胞內(nèi)Ca2+濃度的升高會(huì)使受體對(duì)Ca2+的敏感性提高，增強(qiáng)鈣離子通道的開(kāi)放，促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+的釋放，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，而過(guò)量Ca2+進(jìn)入心肌細(xì)胞是低血氧時(shí)心組織發(fā)生病理變化的機(jī)制。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+過(guò)載的重要緩沖器，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著重要作用。MCU是位于線粒體內(nèi)膜上介導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+進(jìn)入線粒體的重要蛋白，其活性受到MICU1和MCUR1的調(diào)控[6,19-20]。本研究通過(guò)適度低氧對(duì)原代肉雞心肌細(xì)胞進(jìn)行肺動(dòng)脈高壓的造模，探究MCU在心肌細(xì)胞損傷中的作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+來(lái)源于細(xì)胞外Ca2+的進(jìn)入和細(xì)胞器Ca2+的釋放，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+達(dá)到一定濃度時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+反過(guò)來(lái)抑制細(xì)胞器Ca2+的釋放，從而保證細(xì)胞內(nèi)Ca2+的數(shù)量可以觸發(fā)生理功能，又不會(huì)損傷細(xì)胞[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)肉雞心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)增加，與前人的研究結(jié)果一致[22]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的鈣緩沖機(jī)制，包括促進(jìn)細(xì)胞器對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的稀釋，而線粒體對(duì)Ca2+吸收作用在其中扮演重要角色。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧處理肉雞心肌細(xì)胞后，線粒體內(nèi)Ca2+濃度在24和72 h時(shí)，顯著升高。除此之外，心肌細(xì)胞內(nèi)MCU的轉(zhuǎn)錄水平與心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體Ca2+濃度變化一致。因此，低氧導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體Ca2+濃度變化可能與MCU的表達(dá)水平變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MCU在低氧處理心肌細(xì)胞的過(guò)程中，表達(dá)先增加后降低再增加的趨勢(shì)符合線粒體內(nèi)Ca2+濃度變化趨勢(shì)，提示MCU介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)增加的Ca2+進(jìn)入線粒體。線粒體內(nèi)適當(dāng)?shù)腃a2+提升，促進(jìn)線粒體的呼吸功能，但持續(xù)的線粒體鈣超載，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增加，膜電位降低，引發(fā)線粒體發(fā)生損傷。有研究顯示，氧化應(yīng)激信號(hào)促進(jìn)MCU氧化并增加其通道活性，在氯化鈷化學(xué)缺氧開(kāi)始階段，MCU介導(dǎo)線粒體Ca2+攝取導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，活性氧正反饋?zhàn)饔醚趸揎桵CU復(fù)合物，線粒體持續(xù)性Ca2+超載和活性氧積累，過(guò)量的活性氧將對(duì)細(xì)胞組分造成嚴(yán)重?fù)p傷，甚至造成細(xì)胞死亡[23-25]，并導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。隨著線粒體鈣離子濃度增加，可導(dǎo)致mPTP孔開(kāi)放，線粒體會(huì)因?yàn)榛|(zhì)的高滲透壓而迅速吸水膨脹導(dǎo)致線粒體外膜破裂，失去對(duì)離子流動(dòng)的選擇性引起線粒體膜電位崩潰，ATP生成減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化多種心肌肥厚相關(guān)基因，其中MCUmRNA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞肥大已有證明[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧處理早期，MCU介導(dǎo)游離Ca2+進(jìn)入線粒體，激活線粒體脫氫酶，加快線粒體有氧代謝，膜電位升高；隨著低氧處理時(shí)間延長(zhǎng)，低氧組線粒體膜電位降低，這與Giacomello等[28]的研究發(fā)現(xiàn)一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)低氧處理組相比，RU360與低氧聯(lián)合處理組中細(xì)胞和線粒體內(nèi)Ca2+濃度下降，ROS下降，線粒體膜電位上升。說(shuō)明抑制低氧誘導(dǎo)的MCU過(guò)表達(dá)可以減輕線粒體鈣超載，保護(hù)線粒體功能。

4 結(jié) 論

本研究表明,低氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞MCU及其相關(guān)基因和蛋白異常表達(dá)，導(dǎo)致線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體功能下降；抑制MCU表達(dá)可以減輕低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體鈣超載，保護(hù)線粒體功能。