葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞小腸黏膜屏障功能及抗氧化能力的影響

余應(yīng)梅，施 璇，歐陽經(jīng)鑫，劉三鳳，黎觀紅*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心,南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南昌 330045)

油脂是家禽飼糧中的重要能量來源，可改善飼料適口性和一致性，提供必需脂肪酸并增加脂溶性維生素的吸收。但油脂在加工、貯存、運(yùn)輸和飼喂過程中，尤其在高溫季節(jié)易發(fā)生氧化酸敗[1]。動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，攝入氧化油脂會(huì)引起一系列廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，氧化油脂最顯著的負(fù)作用之一是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，這是由攝入的氧化油脂吸收的脂質(zhì)過氧化氫和氧化脂肪誘導(dǎo)微粒體細(xì)胞色素P450酶產(chǎn)生的活性氧(ROS)引起的[2-4]。胃腸道是應(yīng)激反應(yīng)的靶器官，因此，極易受到各種應(yīng)激因素的影響，造成腸黏膜絨毛部分?jǐn)嗔衙撀?，降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收功能，減弱腸道黏膜屏障功能，進(jìn)而引起腸道細(xì)菌易位和內(nèi)毒素侵入機(jī)體并引起其他組織器官功能變化或損傷[5-6]。大量研究表明，飼糧中的氧化酸敗產(chǎn)物可通過多種途徑損傷機(jī)體的正常生理功能，降低機(jī)體抗氧化功能和免疫力，引發(fā)腸道炎癥，造成結(jié)構(gòu)和功能破壞[7-9]。

補(bǔ)充外源性抗氧化劑有助于恢復(fù)氧化和抗氧化平衡[10]，葛根素是一種天然的異黃酮化合物，有報(bào)道稱，葛根素具有較強(qiáng)的抗氧化活性并能發(fā)揮廣泛的有益作用[11]，葛根素具有清除自由基、抑制促炎細(xì)胞因子、降低炎癥基因、上調(diào)抗氧化酶、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路的作用[12]。葛根素顯著降低肺損傷模型大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)和血漿丙二醛(MDA)水平，并顯著提高血漿超氧化物歧化酶(SOD)活性[13]。葛根素可逆轉(zhuǎn)肺損傷小鼠肺泡和毛細(xì)血管基底膜厚度增加及II型肺泡上皮細(xì)胞微絨毛和嗜鋨性板層小體數(shù)量減少[14]。然而，葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞腸道氧化損傷的保護(hù)作用卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討飼喂氧化大豆油對(duì)肉雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗氧化能力的影響及葛根素的調(diào)節(jié)作用，以期為葛根素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 氧化大豆油的制備

氧化大豆油的制備參考Liang等[15]的方法。新鮮大豆油為市售精煉一級(jí)食用大豆油。新鮮大豆油在沸水浴中連續(xù)加熱10 h，并且持續(xù)通入空氣。分別在加熱第4、7、9和10小時(shí)測(cè)定大豆油的過氧化值(POV)和丙二醛(MDA)的含量。當(dāng)POV≥90 meq·kg-1時(shí)，氧化大豆油制備結(jié)束。油脂POV的測(cè)定方法參考GB/T 5538—2005，MDA含量的測(cè)定方法參考GB 5009.181—2016。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，因子包括大豆油和葛根素。大豆油按其品質(zhì)分為新鮮大豆油(POV=1.53 meq·kg-1，MDA =0.18 mg·kg-1)和氧化大豆油(POV=(95±2)meq·kg-1，MDA =26.41 mg·kg-1)。飼糧中葛根素添加量為0和750 mg·kg-1兩個(gè)水平，本試驗(yàn)所用的葛根素購自楊凌慈緣生物科技有限公司，純度為98.31%，批次號(hào)為CY190320。選取1日齡健康雌性中速型三黃雞肉雞360羽，隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15羽。試驗(yàn)期56 d。4個(gè)處理組分別為新鮮大豆油飼糧組、新鮮大豆油+葛根素(750 mg·kg-1)飼糧組、氧化大豆油飼糧組和氧化大豆油+葛根素(750 mg·kg-1)飼糧組。1～28日齡油脂添加量為2%，29～56日齡油脂添加量為3%。

1.3 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)采用的基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，根據(jù)我國NT/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》推薦的營養(yǎng)水平，按1～28、29～56日齡兩個(gè)階段進(jìn)行配制。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)雞采用三層籠籠養(yǎng)。試驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行充分沖洗和嚴(yán)格消毒，入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃，此后溫度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃。采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)。試驗(yàn)期舍內(nèi)光照、濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行控制，雞只按正常免疫程序進(jìn)行免疫。整個(gè)試驗(yàn)期雞只自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

1.4 樣品的采集與制備

在28和56日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只雞，取十二指腸、空腸、回腸中上段，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物，浸沒在10%福爾馬林固定液中固定，用于腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)分析。取十二指腸、空腸、回腸中下段用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈內(nèi)容物，放于冰盒上，用載玻片刮取黏膜，分裝于凍存管中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于目的基因mRNA表達(dá)量和抗氧化指標(biāo)測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 將固定好的小腸組織樣品經(jīng)沖洗過夜、脫水、包埋、連續(xù)切片、攤片、蘇木精-伊紅染色和封片，得到的切片用Motic Images Advanced3.2測(cè)量其絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)并計(jì)算絨毛高度和隱窩深度比值(V/C)。

1.5.2 小腸黏膜occludin、claudin-1和ZO-1基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定 采用TRIzol(北京全式金生物技術(shù)有限公司)法提取腸黏膜組織總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)測(cè)定RNA的濃度和純度，將得到的RNA放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，得到的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＠肂io-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系如下：Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,Passive Referenec Dye (50×)0.4 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，樣品cDNA 2 μL，RNase-free 水6.8 μL。引物序列見表2，引物的堿基序列由華大基因有限公司合成。目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法分析，內(nèi)參基因選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.5.3 小腸黏膜抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定小腸黏膜SOD活性、T-AOC、GSH-Px活性、過氧化氫酶(CAT)活性、GSH和MDA含量，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS24.0軟件中的Two-way ANOVA過程進(jìn)行雙因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，在28和56日齡時(shí)，相對(duì)于飼喂新鮮大豆油組，飼喂氧化大豆油不添加葛根素組肉雞十二指腸、空腸和回腸絨毛均出現(xiàn)明顯的斷裂破碎損傷，而添加葛根素明顯改善3個(gè)腸段的絨毛結(jié)構(gòu)。

由表3可知，與飼喂新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡十二指腸的絨毛高度、V/C和回腸的V/C以及56日齡肉雞十二指腸和空腸的絨毛高度和V/C(P<0.05)，56日齡肉雞空腸和回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)。飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡空腸絨毛高度、V/C和56日齡肉雞3個(gè)腸段的V/C及空腸的絨毛高度(P<0.05)，顯著降低56日齡3個(gè)腸段的隱窩深度(P<0.05)。氧化大豆油和葛根素對(duì)28日齡肉雞十二指腸和回腸以及56日齡肉雞空腸和回腸的隱窩深度和V/C，28日齡空腸的絨毛高度和V/C存在顯著的交互作用(P<0.05)。飼喂氧化大豆油使28日齡黃羽肉雞空腸絨毛高度、V/C及十二指腸和回腸V/C，56日齡3個(gè)腸段的V/C顯著降低(P<0.05)，并使28日齡十二指腸和回腸的隱窩深度及56日齡3個(gè)腸段的隱窩深度顯著升高(P<0.05)，而飼糧中添加葛根素顯著升高飼喂氧化大豆油28日齡黃羽肉雞空腸絨毛高度、V/C及十二指腸和回腸V/C以及56日齡3個(gè)腸段的V/C(P<0.05)，顯著降低28日齡十二指腸和回腸及56日齡3個(gè)腸段的隱窩深度(P<0.05)。

表3 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞小腸形態(tài)的影響Table 3 Effects of puerarin on the intestinal morphology of broilers fed oxidized soybean oil

2.2 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞腸黏膜緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響

由表4可知，與飼喂新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡肉雞回腸claudin-1 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，并有降低56日齡回腸occludinmRNA表達(dá)量的趨勢(shì)(P=0.068)。飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞回腸的ZO-1 mRNA表達(dá)量(P<0.05),并有提高28日齡空腸ZO-1(P=0.083)和56日齡回腸occludin(P=0.057)mRNA表達(dá)量的趨勢(shì)。氧化大豆油和葛根素對(duì)28日齡和56日齡肉雞小腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量不存在顯著的交互作用。

表4 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞腸粘膜緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響Table 4 Effects of puerarin on the expression of tight junction protein mRNA in intestinal mucosa of 28-day-old broilers fed oxidized soybean oil

2.3 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油黃羽肉雞小腸黏膜抗氧化能力的影響

由表5可知，與飼喂新鮮大豆油相比，飼喂氧化大豆油顯著提高28日齡十二指腸GSH含量和空腸GSH-Px活性(P<0.05),并顯著降低28日齡回腸GSH含量、SOD活性和T-AOC以及56日齡回腸SOD活性和T-AOC(P<0.05)，并有提高56日齡回腸MDA含量的趨勢(shì)(P=0.076)。飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞十二指腸GSH-Px活性以及56日齡肉雞十二指腸SOD活性和回腸SOD、GSH-Px活性(P<0.05)，并有提高56日齡回腸GSH含量的趨勢(shì)(P=0.056)。飼糧中添加葛根素顯著降低56日齡空腸GSH含量、SOD活性、T-AOC及回腸T-AOC(P<0.05)。氧化大豆油和葛根素對(duì)28日齡和56日齡肉雞十二指腸CAT活性存在顯著交互作用(P<0.05)。在氧化大豆油組中添加葛根素可顯著提高28日齡回腸SOD活性，顯著提高56日齡十二指腸CAT和SOD活性以及回腸SOD活性和GSH的含量(P<0.05)。

表5 葛根素對(duì)飼喂氧化油脂肉雞小腸黏膜抗氧化能力的影響Table 5 Effects of puerarin on antioxidant capacity of small intestinal mucosa in broilers fed oxidized oil

3 討 論

腸絨毛具有吸收功能，絨毛高度和絨毛表面積可以表示其吸收功能的強(qiáng)弱[16]，分泌是隱窩的主要功能，從隱窩的深淺得到腸上皮細(xì)胞的生成率，絨毛高度/隱窩深度(V/C)的比值則反映了腸道消化吸收的能力[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化大豆油使3個(gè)腸段的絨毛高度及V/C顯著降低，隱窩深度顯著升高，這說明飼喂氧化大豆油嚴(yán)重破壞了腸道的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道的消化吸收功能下降。這與張志浩[18]的研究一致，其試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化油脂造成肉雞腸道病理學(xué)變化，導(dǎo)致腸道形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞。前人研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加葛根素可以改善細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和屏障功能[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加葛根素顯著提高肉雞小腸的絨毛高度和V/C，隱窩深度顯著降低，說明飼糧中添加葛根素可改善肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)小腸屏障功能。氧化大豆油和葛根素對(duì)28和56日齡肉雞小腸的絨毛高度、隱窩深度和V/C存在顯著的交互作用，飼喂氧化大豆油破壞了腸道的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，而飼糧中添加葛根素顯著升高飼喂氧化大豆油黃羽肉雞3個(gè)腸段的V/C并顯著降低3個(gè)腸段的隱窩深度，說明在氧化大豆油飼糧中添加葛根素在一定程度上改善了氧化損傷條件下肉雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)氧化損傷條件下腸道消化吸收能力具有一定的修復(fù)作用。

A.新鮮大豆油不加葛根素組；B.新鮮大豆油+葛根素組；C.氧化大豆油不加葛根素組；D.氧化大豆油+葛根素組A.Fresh soybean oil without puerarin group;B.Fresh soybean oil with puerarin group;C.Oxidized soybean oil without puerarin group;D.Oxidized soybean oil with puerarin group圖1 葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(40×)Fig.1 Effect of soybean oil and puerarin on the intestinal morphology of broilers (40×)

腸上皮緊密連接蛋白在腸屏障中起著重要作用，因?yàn)樗鼘?duì)維持腸黏膜通透性至關(guān)重要，這些蛋白的丟失會(huì)導(dǎo)致的腸道屏障的破壞，出現(xiàn)腹瀉、腸出血等癥狀[20]。在本研究中，通過熒光定量PCR分析了claudin-1、occludin和ZO-1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，在飼喂氧化大豆油肉雞小腸黏膜中claudin-1的表達(dá)減少，從而破壞了腸道屏障功能。飼糧中添加葛根素可通過提高肉雞小腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1 mRNA的表達(dá)量，改善腸上皮屏障功能障礙，有效阻止屏障完整性的破壞，這一結(jié)果與Jeon等[21]的報(bào)道相似，其試驗(yàn)結(jié)果顯示，敵草快誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的緊密連接蛋白表達(dá)減少，口服葛根素使ZO-1、occludin和claudin-1的表達(dá)增加。本研究中，絨毛高度/隱窩深度和ZO-1 mRNA的表達(dá)增加，證明了葛根素對(duì)飼喂氧化大豆油肉雞腸道屏障功能得到了恢復(fù)，黏膜屏障功能的改善可能預(yù)示著氧化損傷的減輕。

氧化應(yīng)激會(huì)造成胃腸道損傷，但機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)可以抵消過量活性氧造成的影響。這些防御機(jī)制確保ROS/RNS的濃度得到控制，不會(huì)產(chǎn)生有害影響。內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)主要由細(xì)胞內(nèi)的酶抗氧化物組成，如SOD、GPX和CAT；細(xì)胞內(nèi)的非酶抗氧化物GSH；細(xì)胞外抗氧化物包括礦物質(zhì)、銅藍(lán)蛋白、維生素和尿酸[22]，這些指標(biāo)都可以作為評(píng)判機(jī)體的抗氧化能力。但評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)部抗氧化能力不能只依據(jù)單一指標(biāo)的高低，應(yīng)該從系統(tǒng)平衡的角度去衡量。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂氧化大豆油顯著升高28日齡肉雞十二指腸GSH和空腸GSH-Px含量并顯著降低回腸GSH、SOD和T-AOC含量，顯著降低56日齡肉雞回腸SOD和T-AOC的含量，說明飼喂氧化大豆油使肉雞體內(nèi)氧化-抗氧化失衡，造成氧化應(yīng)激，與Lindblom等[23]人的研究結(jié)果一致。油脂的水解產(chǎn)物主要是在十二指腸和空腸中被吸收[24]，而28日齡肉雞十二指腸GSH和空腸GSH-Px含量升高可能是由于十二指腸和空腸消化吸收的氧化大豆油飼糧中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物激活機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，所以機(jī)體釋放大量的抗氧化物來抵消過量活性氧造成的影響，在回腸中抗氧化酶顯著降低可能是由于攝入脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物過度激活體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，直到抗氧化系統(tǒng)不堪重負(fù)，消耗大量的抗氧化酶，使回腸中的抗氧化物顯著降低。葛根素作為一種植物類黃酮，其抗氧化應(yīng)激作用已被證實(shí)。在非細(xì)胞系統(tǒng)中，它能抑制Cu2+誘導(dǎo)的高密度脂蛋白的氧化[25]，而在細(xì)胞基礎(chǔ)檢測(cè)中，葛根素是一種有效的ROS清除劑，可以通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)汞、H2O2、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、魚藤酮誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加葛根素可提高氧化損傷條件下28日齡肉雞回腸GSH含量，56日齡十二指腸SOD活性，回腸GSH含量和SOD的活性而提高其抗氧化能力，表明飼糧中添加葛根素可以提高氧化損傷條件下肉雞腸道抗氧化能力。

4 結(jié) 論

4.1飼喂氧化大豆油破壞腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)量，添加葛根素可提高肉雞小腸黏膜緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)量，改善氧化損傷條件下腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。

4.2飼喂氧化大豆油顯著降低28日齡回腸GSH含量、SOD活性、T-AOC以及56日齡回腸GSH含量和SOD活性，飼糧添加葛根素可提高氧化損傷條件下28日齡肉雞回腸GSH含量、56日齡十二指腸SOD活性以及回腸GSH含量和SOD活性而提高其抗氧化能力。