過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響

洪倩倩，郭 宏，高樹新*，郭益文*

(1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術(shù)學院，通遼 028000；2.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384)

骨骼肌是動物體的重要組成部分，其重量達到動物自身體重的40%。目前關(guān)于基因MyBPC1的研究多數(shù)為肌肉疾病及癌癥方面。而關(guān)于MyBPC1調(diào)控牛肌肉分化的相關(guān)研究知之甚少。本試驗在前期研究的基礎上，通過上調(diào)牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中MyBPC1的表達，分析其對細胞增殖分化的影響，進而探究基因MyBPC1調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的作用機制，為牛骨骼肌發(fā)育調(diào)控機制研究提供理論依據(jù)，研究結(jié)果對動物肉用性狀的改良有著重要的科學意義。

動物機體及體內(nèi)臟器的活動完全依賴肌肉的收縮和舒張功能，其中骨骼肌發(fā)揮著不可替代的作用。同時還可作為分泌器官分泌多種肌肉因子，與其他器官協(xié)同完成機體的各種活動[1]。骨骼肌的調(diào)節(jié)機制是一個高度協(xié)調(diào)的過程，能夠參與多種細胞因子的激活和生命活動的調(diào)節(jié)[2]。骨骼肌干細胞為動物機體提供了大量的肌源性細胞，這些細胞經(jīng)增殖、分化、融合發(fā)揮各自的功能[3]。成肌細胞融合對于肌纖維的形成是必不可少的。這些細胞在1961年首次被發(fā)現(xiàn)，許多科研人員探究了它們的胚胎起源以及在肌肉再生和修復中所起的確切作用[4]。肌球蛋白結(jié)合蛋白C1(myosin binding protein C1，MyBPC1)是一種豐富的骨骼肌蛋白，主要在慢收縮肌纖維中表達。肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MyBP-C)家族是一組對橫紋肌結(jié)構(gòu)和功能有重要影響的肌球蛋白結(jié)合蛋白，約占肌絲質(zhì)量的2%，在肌肉收縮和松弛過程中起著重要的作用，因此，動物骨骼肌的分子調(diào)控機制備受關(guān)注。有研究表明，在胚胎骨骼肌中檢測到基因MyBPC1的表達[5]。根據(jù)表達的序列標簽提供有關(guān)轉(zhuǎn)錄組信息進行差異表達基因篩選，證實了MyBPC1等基因與肌發(fā)生有關(guān)系，且這些基因表現(xiàn)為產(chǎn)前高表達[6]。曾有學者研究表明，黑肉牛骨骼肌中基因MyBPC1的SNP位點與生長性狀[7]和大理石花紋[8]有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，肌肉收縮需要的高能量是由肌型肌酸激酶(MM-CK)提供，且MM-CK與慢MyBPC1相互作用[9]。還有研究提示，MyBPC1作為連接ATP消費者(肌球蛋白)和再生器(MM-CK)的適配器，具有有效的能量代謝和同質(zhì)平衡作用[10]。同時，MyBPC1介導肌球蛋白型肌酸激酶(CK)的合成[10]，這些研究結(jié)果證明了MyBPC1在骨骼肌的定位、肌肉病變和能量轉(zhuǎn)換中的重要作用。

近幾年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)MyBPC1在動物病變肌肉中差異表達，但在肌肉生長發(fā)育中的作用還未可知，本研究就過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響進行了試驗。分別在mRNA和蛋白水平上對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化標志因子進行了檢測。有研究表明，Pax7[11-12]和Ki67[13-15]基因在臨床上可被廣泛用作一種增殖標志因子。同時Pax7在肌肉產(chǎn)生過程中起著重要的重疊作用[16-17]。電刺激肌衛(wèi)星細胞會使基因Pax7 的mRNA 水平和MyoD、Myogenin、MyHC[18-20]的蛋白水平增加，這些標志因子表達量的增加促進了肌衛(wèi)星細胞的分化[21]。MyHC和MyOG基因的表達變化可監(jiān)測肌衛(wèi)星細胞的分化狀態(tài)[22]。MyOD基因是肌細胞融合的關(guān)鍵因子，同時也可以誘導肌肉細胞多核表達[23]。肌球蛋白重鏈胚胎(MyHC)是一種在肌肉發(fā)育過程中表達的骨骼肌特異性收縮蛋白[24]。上述研究證明，MyBPC1可能對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化有潛在的調(diào)控作用，但過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響尚不清楚。本研究利用成功構(gòu)建的MyBPC1過表達模型，通過在RNA和蛋白水平同時上調(diào)MyBPC1的表達分析MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和成肌分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

LightCycle96熒光定量PCR儀(Roche公司，瑞士)；低溫高速離心機 centrifuge 5810R(Eppendorf，德國)；細胞恒溫培養(yǎng)箱(三洋電機公司，日本)；倒置顯微鏡(Leica，德國)；PowerPac Basic 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、Nano-Drop ND 2000c Spectrophotometer(Thermo scientific，德國)；垂直電泳槽、超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)等。

1.2 主要試劑

DMEM、FBS (Fetal Bovine Serum)、HS (HorseSerum)、Opti-MEM;0.25%胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；si-RNA購自廣州銳博公司；BCA試劑盒購自北京康為公司；Lipofectamine 3000 Rea-gent 購自賽默飛公司；Pax7 和MyHC 一抗購自DSHB 公司；GAPDH一抗、羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；MyBPC1一抗購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA快速提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa biotechnology Corporation;All-in-One’M qPCR Mix購自GeneCopoeia；引物由北京擎科生物科技有限公司合成；過表達載體(pcDNA3.1)由蘇州鴻訊生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.3 試驗時間和地點

試驗時間是2020年5月到2021年1月，地點在天津農(nóng)學院天津市農(nóng)業(yè)動物繁育及健康養(yǎng)殖重點實驗室。

1.4 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞培養(yǎng)前處理

牛骨骼肌衛(wèi)星細胞由天津農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室分離并凍存，該技術(shù)已獲批國家專利，具體方法參考王軼敏等[25]的研究。

進入細胞培養(yǎng)程序前,需要確保培養(yǎng)細胞過程中所用到的試驗器材、試劑、環(huán)境均保持無菌狀態(tài)，以防細胞污染，增殖培養(yǎng)基為20%FBS+80%DNEM。分化培養(yǎng)基為2% HS+98% DMEM。細胞培養(yǎng)包括細胞復蘇和細胞傳代兩部分。

細胞復蘇：將凍存的原代牛骨骼肌衛(wèi)星細胞從液氮罐中取出，并迅速將其置于37 ℃恒溫水浴鍋中，并充分搖晃使之在1～2 min內(nèi)盡快解凍，防止緩慢融化使細胞重吸收水分而導致細胞內(nèi)產(chǎn)生再結(jié)晶，對細胞有損并可能會降低細胞活力。在不能讓凍存的細胞完全融化的條件下，立即加入相等體積的提前預熱好增殖培養(yǎng)基進行中和，并立即吹吸混勻，可防止原凍存液中的成分損傷細胞。將含有細胞的液體轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r·min-1離心10 min。離心后小心棄掉上清液，用增殖培養(yǎng)基輕輕吹吸細胞，使細胞重懸，將細胞根據(jù)分離凍存時的細胞量均勻的接種于直徑為60 mm的增養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，需要及時用顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)。

細胞傳代：細胞在進入對數(shù)生長期并且達到匯合狀態(tài)時會發(fā)生接觸性抑制，細胞濃度的快速升高將導致細胞代謝速度加快，同時細胞增殖也可能會導致培養(yǎng)基的消耗速度加快。因此，為使細胞更好地進一步增殖，需要將其進行傳代。當細胞密度達80%左右時進行傳代，傳代時首先將原細胞培養(yǎng)基吸棄，沿培養(yǎng)皿內(nèi)壁緩慢滴加無菌 PBS清洗掉原代細胞分離后的一些雜質(zhì)或死細胞。然后再加入足以覆蓋培養(yǎng)皿中細胞的0.25%胰酶，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 min，用來消化貼壁生長的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞。立即置于倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞消化好后，立即加入等體積提前預熱的增殖培養(yǎng)基終止消化，以防細胞消化過度受到傷害。再將其收集到全新無菌的離心管中離心,收集細胞沉淀。再重復細胞沉淀重懸步驟，根據(jù)后續(xù)試驗所需細胞量，提前設計好所需細胞的接種面積，按30%密度接種至不同細胞孔板中進行繼續(xù)增殖培養(yǎng)。

1.5 試驗設計

利用qRT-PCR檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞正常分化進程中MyBPC1的mRNA表達水平變化，利用 Western blot法檢測MyBPC1在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞正常分化進程中蛋白表達水平的變化。

合成pcDNA3.1-MyBPC1質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞內(nèi)，以空載體(pcDNA3.1)轉(zhuǎn)染細胞作為對照。轉(zhuǎn)染處理后24 h為增殖期(GM)，qRT-PCR及Western blot法檢測更換分化培養(yǎng)基24(DM1)、48(DM2)、72 h(DM3)的干擾效果。

利用光學顯微鏡觀察牛骨骼肌衛(wèi)星細胞誘導分化后各個時期肌管形成狀態(tài)，qRT-PCR檢測增殖期標志因子Pax7和Ki67以及分化期標志因子MyOG和MyHC的表達情況，Western blot檢測增殖期標志因子Pax7和分化標志因子MyHC的蛋白表達水平。結(jié)合以上結(jié)果綜合分析過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化的影響。

1.6 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)

將液氮內(nèi)凍存的細胞在37 ℃水浴中復蘇，用1 mL 增殖培養(yǎng)基(20%FBS+80%DNEM)室溫中和，1 000 r·min-1離心10 min，移除上清液，重新加入適量的增殖培養(yǎng)基重懸，置于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中復蘇。待細胞鋪滿培養(yǎng)皿80%時傳代，用37 ℃ 預熱的PBS清洗細胞1次，加入1 mL 0.25%胰酶放培養(yǎng)箱消化1 min，加入1 mL增殖培養(yǎng)基中和胰酶，室溫1 000 r·min-1離心10 min，移除上清液，加入適量的增殖培養(yǎng)基重懸，傳代到細胞培養(yǎng)板中。待細胞密度度達到80%，加入分化培養(yǎng)基(2% HS+98% DMEM)進行體外誘導分化。整個培養(yǎng)過程為無菌操作。

1.7 實時熒光定量PCR檢測基因表達

利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit 進行cDNA第一鏈的合成，利用All-in-OneTMqPCR Mix進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)。mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應程序為：42 ℃ 15 min;85 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于下游試驗，將反轉(zhuǎn)錄模板稀釋3倍用于定量試驗。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。反應體系中所涉及引物見表1。

表1 qRT-PCR檢測所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR detection

1.8 Western blot檢測蛋白表達

使用BCA試劑盒測定裂解細胞的蛋白濃度，主要分為：BSA標準品稀釋、待測蛋白的稀釋、BCA工作液的配置、微孔板檢測。繪制出標準曲線并計算目的蛋白濃度。分別檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化進程中MyBPC1的表達、增殖期Pax7的表達和分化期MyHC的表達情況。

1.9 統(tǒng)計分析

每組試驗均設置3個生物學重復，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示。qRT-PCR結(jié)果按2AC法計算，采用t檢驗進行差異顯著性分析，以GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)z測的目的基因的表達量進行歸一化。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞正常分化進程中MyBPC1的表達

將牛骨骼肌衛(wèi)星細胞復蘇，分別傳代到24孔板和6孔板上，待細胞貼壁生長后，增殖24 h。隨后更換分化培養(yǎng)基誘導細胞分化24、48、72 h為分化DM1、DM2、DM3，采用qRT-PCR和Western blot檢測MyBPC1在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化過程中的表達差異，如圖1顯示，MyBPC1在分化第3天的表達極顯著高于增殖期，且表達量最高(P<0.01)，說明MyBPC1可能對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化有一定的調(diào)控作用。

A.牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化進程鏡像圖(GM，100×；DM1、DM2、DM3，4×)；B.牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化進程中MyBPC1 mRNA水平；C、D.牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化進程中MyBPC1的蛋白水平及其量化圖A.Mirror image of the differentiation process of bovine skeletal muscle satellite cells(GM，100×；DM1,DM2,DM3，4×);B.MyBPC1 mRNA level during the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells;C,D.MyBPC1 protein level and its quantification map during the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells圖1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞在分化進程中MyBPC1的表達Fig.1 The expression of MyBPC1 during differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells

2.2 過表達MyBPC1模型的建立

為了探究MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響，本研究體外培養(yǎng)了牛骨骼肌衛(wèi)星細胞。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MyBPC1基因序列，構(gòu)建pcDNA3.1-MyBPC1過表達質(zhì)粒(由生物公司合成)。分別轉(zhuǎn)染進細胞中，收集增殖期細胞，提取RNA，利用qRT-PCR檢測MyBPC1的mRNA水平的表達效率，結(jié)果如圖2A所示。檢測分化期的過表達效率，如圖2B所示，各時期均有明顯的過表達效果(P<0.01)。

A.增殖期MyBPC1的過表達效率；B.分化期的MyBPC1的過表達效率A.Overexpression efficiency of MyBPC1 in the proliferation phase;B.Overexpression efficiency of MyBPC1 in the differentiation phase圖2 在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中MyBPC1過表達模型的構(gòu)建Fig.2 Construction of the overexpression model of MyBPC1 in bovine skeletal muscle satellite cells

2.3 過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響

在成功構(gòu)建MyBPC1過表達模型的基礎上，進一步研究過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響。利用定量PCR和Western blot技術(shù)檢測肌細胞增殖和分化標志基因表達情況，確定MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響。結(jié)果顯示，過表達MyBPC1后，增殖標志因子Pax7和Ki67 mRNA均無顯著變化(P>0.05，圖3A)，與蛋白水平Pax7的表達一致(圖3E、F)。根據(jù)細胞總體增殖狀態(tài)來看，過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖無顯著影響。在分化期，分化標志因子MyHC和MyOGmRNA表達量極顯著上升(P<0.01，圖3B、C、D)；MyHC蛋白表達量極顯著上升(P<0.01)，同時明顯提升肌管的生成數(shù)目(圖3G、H)。根據(jù)細胞鏡像圖總體分化狀態(tài)來看(圖3I)，過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化有促進作用。

A.細胞增殖標志因子mRNA的水平；B、C、D.DM1、DM2、DM3分化標志因子mRNA的水平；E、F.細胞增殖標志因子蛋白水平及其量化圖；G、H.細胞分化標志因子蛋白水平及其量化圖；I.過表達MyBPC1牛骨骼肌衛(wèi)星細胞鏡像圖(4×)A.The level of mRNA of cell proliferation marker factors;B,C,D.The mRNA levels of DM1,DM2 and DM3 differentiation marker factors,respectively;E,F.Cell proliferation marker factor protein level and its quantification diagram;G,H.Cell differentiation marker factor protein level and its quantification diagram;I.Mirror image of bovine skeletal muscle satellite cells after overexpressing MyBPC1(4×)圖3 過表達MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響Fig.3 Effects of overexpression of MyBPC1 on the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells

3 討 論

骨骼肌生長發(fā)育是一個復雜的生理過程，每個細微的過程都有不同基因和不同的調(diào)控機制，以及各種信號通路的參與?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡的精細調(diào)控貫穿于動物肌肉的整個生長發(fā)育過程，它能夠調(diào)節(jié)肌纖維的數(shù)目、類型以及生長速度。肌纖維是骨骼肌的功能單位。本實驗室前期鑒定出了一條lncRNA，命名為lnc23，證實其對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞有明確的調(diào)控作用，下調(diào)lnc23可抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化，同時轉(zhuǎn)錄組學篩選到了MyBPC1表達量的顯著變化，因此本研究構(gòu)建了MyBPC1的過表達細胞模型，探究上調(diào)MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響。本試驗結(jié)果顯示，過表達MyBPC1后各個時期的標志因子mRNA與蛋白水平表達相一致。越來越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是決定細胞因子mRNA水平的決定因素，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控通過核糖體調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[26-27]。

MyBPC1有很多異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)錯綜復雜，MyBP-C是個家族蛋白，哺乳動物肌肉中存在3種不同的MyBP-C亞型：慢骨骼(MyBPC1)、快速骨骼(MyBP-C2，含多種變異體)和心肌(cMyBP-C3)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C(cMyBP-C3)是一種與收縮器中厚、薄、Titin纖維系統(tǒng)相聯(lián)系的完整蛋白，其功能受本身翻譯后修飾的嚴格調(diào)控[28]。MyBPC1大小為128 ku，且是3個異構(gòu)體的類似物，由不同的基因編碼，在橫紋肌中有不同的表達譜[29]，包括多種輔助性蛋白，且具有相同的結(jié)構(gòu)和序列同源性[30]。研究表明，人體內(nèi)MyBPC3基因頻繁突變導致心肌細胞過度分化，在家族性肥厚型心肌病的確診病例中高達30%～35%。有報道稱，干擾慢肌纖維MyBPC1表達會抑制肉雞乳腺肌衛(wèi)星細胞的增殖分化[31]。在黃肉仔雞發(fā)育期肌肉生長和肌內(nèi)脂肪代謝差異表達基因的鑒定中MyBPC1基因的上調(diào)表達被認為與肌纖維肥大密切相關(guān)[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，MyBPC1基因與乳腺癌細胞擴增顯著相關(guān)[33]。還有學者研究發(fā)現(xiàn)，MyBPC1基因是 TMPRSS 2-ERG前列腺癌分子的一個亞型[34]。綜上所述，MyBPC1高表達能促進細胞的分化，與本研究結(jié)果一致。

相對于MyBPC1在其他生物學過程中(如肌肉疾病)作用機制的研究，如MyBPC1基因是肌源性震顫[35]、患有陰囊疝豬的腹股溝區(qū)肌肉生理失衡[36]、兒童胰膽合并癥[37]和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[38]等疾病的潛在生物標志物，本研究為此類肌肉疾病的診斷和治療提供了研究基礎。但MyBPC1對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的研究仍有較少的報道，所以本研究針對上調(diào)MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響進行了一系列試驗，結(jié)果顯示，上調(diào)MyBPC1可促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化。

根據(jù)最新研究報道，下調(diào)MyBPC1對雞胸肌RBCH衛(wèi)星細胞增殖無顯著影響，而對Ross 708衛(wèi)星細胞的增殖具有明顯的抑制作用。因此，MyBPC1表達對衛(wèi)星細胞增殖的影響是根據(jù)衛(wèi)星細胞種類的不同而有所不同[39]，與本研究中過表達MyBPC1對西門塔爾牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖無顯著影響有共同之處。MyBPC1是分化期后期的下游靶蛋白，對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞前期增殖期的影響很小。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，MyBPC1對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化具有明顯的調(diào)控作用。過表達MyBPC1可以促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化，本研究探明了過表達MyBPC1在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化中的作用，為進一步開展MyBPC1調(diào)控牛骨骼肌分化機制研究提供了參考。