山羊HABP4基因的克隆、序列分析及功能預(yù)測(cè)

王憲軍，向 華*，張煥容，任玉鵬，朱江江

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(hyaluronan binding protein 4,HABP4)又被稱為Ki-1/57，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中。HABP4蛋白含有多個(gè)RGG/RXR盒族，這些被看做是精氨酸甲基化的靶標(biāo)[1]。透射電鏡分析顯示，該蛋白不僅存在于細(xì)胞質(zhì)，還存在于細(xì)胞核和核孔，推測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位的多變性可能與該蛋白中存在精氨酸和賴氨酸殘基相關(guān)，這些殘基能與一些帶負(fù)電荷的生物大分子相結(jié)合，包括葡糖氨基葡聚糖、RNA、透明質(zhì)酸，因此，它也被稱為細(xì)胞內(nèi)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，這也暗示了HABP4蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著多種功能[2]。

HABP4蛋白最初在細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)可作為單克隆抗體Ki-1的細(xì)胞內(nèi)交叉反應(yīng)物，且是第一個(gè)用于特異性檢測(cè)霍奇金淋巴瘤惡性細(xì)胞的抗體[3]。盡管HABP4和霍奇金病之間關(guān)系尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，HABP4蛋白參與了腫瘤的發(fā)生，如Gray-Mcguire等[4]在分析家族性結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)SNP中發(fā)現(xiàn)，其和HABP4的SNP存在強(qiáng)烈的不平衡性。此外，HABP4蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，可通過(guò)與多種蛋白相互作用，在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄控制與基因表達(dá)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。Lemos等[5-7]發(fā)現(xiàn)，HABP4蛋白與染色質(zhì)重塑蛋白(chromodomain helicase DNA binding protein 3,CHD3)、轉(zhuǎn)錄因子(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C和p53)相互作用后在生物體轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面直接或者間接地發(fā)揮作用。Bressan等[8-11]報(bào)道，HABP4蛋白與hnRNPQ(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)和SFRS9(arginine/serine-rich 9)蛋白作用后調(diào)控mRNA前體的拼接，以及與 RACK1(receptor for activated C kinase 1)、CIRP(cold inducible RNA binding protein)、FMRP(fragile X mental retardation protein)和RPL38(ribosomal protein L38)蛋白作用后調(diào)控蛋白的翻譯。Bressan等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HABP4蛋白通過(guò)與富U RNA探針的結(jié)合參與RNA的新陳代謝過(guò)程，且具有深入調(diào)節(jié)mRNA前體拼接和翻譯方面的功能。2013年，Braunschweig等[12]發(fā)現(xiàn)，HABP4蛋白在mRNA的拼接、核染色質(zhì)重建、轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮作用，暗示此蛋白在調(diào)控整合基因的表達(dá)過(guò)程中具有重要作用。同時(shí)，HABP4蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)RNA的代謝作用[8]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)微陣列數(shù)據(jù)分析顯示，HABP4蛋白的表達(dá)調(diào)控了人源細(xì)胞周期、凋亡、增殖相關(guān)基因表達(dá)水平[13]。HABP4蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)本質(zhì)上屬于非結(jié)構(gòu)蛋白家族的成員之一，其結(jié)構(gòu)的靈活性也暗示了該蛋白能與許多不同的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[14]，推測(cè)HABP4蛋白可能通過(guò)對(duì)生物體轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程的調(diào)節(jié)從而參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、mRNA代謝等[15-17]。由此看出，HABP4蛋白在生物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。基于此，研究人員對(duì)該蛋白產(chǎn)生了濃厚的興趣并進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。然而，目前尚未見(jiàn)HABP4蛋白在調(diào)控山羊細(xì)胞凋亡中作用的相關(guān)報(bào)道。

簡(jiǎn)州大耳羊是我國(guó)自主培育的第二個(gè)肉用山羊品種，具有生長(zhǎng)發(fā)育快、適應(yīng)性好、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，充分挖掘簡(jiǎn)州大耳羊的品種優(yōu)勢(shì)對(duì)推動(dòng)肉用山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本試驗(yàn)以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用TA法克隆得到山羊HABP4基因，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)及功能；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)分析其在不同組織中的表達(dá)；同時(shí)，使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)與HABP4蛋白可能存在相互作用的10個(gè)蛋白的mRNA表達(dá)特性并分析其相關(guān)性，進(jìn)行HABP4基因及相關(guān)基因的GO功能富集，以期為進(jìn)一步驗(yàn)證HABP4在調(diào)控山羊細(xì)胞凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及總RNA提取

試驗(yàn)于2020年在西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院完成。于四川省簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司隨機(jī)選取10月齡左右，體重為55 kg左右的健康簡(jiǎn)州大耳羊公羊16只，作為16個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本。清晨空腹屠宰后，迅速采集各只山羊心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸、瘤胃和胰腺9個(gè)組織樣品，DEPC水清洗后將組織樣品用錫箔紙包好，立刻置于液氮中保存，待用。使用TRIzol法提取組織總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。采用NanoDropND-1000(Agilent)分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度以及OD260 nm/OD280 nm值，并控制在1.9～2.1之間。利用gDNAse去除基因組DNA后，使用QuantiTect Reverse Transcription Kit進(jìn)行cDNA鏈的合成。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA的質(zhì)量。

1.2 主要試劑及儀器

TRIzol、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒、QuantStudio3購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Premix Taq、DL2000 DNA Marker、pMD-19T Simple載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；氯仿、異丙醇、DEPC等均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 山羊HABP4基因的克隆及鑒定

參照GenBank 中已公布的山羊HABP4基因預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_018052483.1)，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物:5′-GGCTTCGCTAAGACTCGC-3′，下游引物：5′-G-TGTCTGGAGAAATCCCTGTT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以山羊脾cDNA為模板，使用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)正確后，切膠回收產(chǎn)物連接至pMD-19T Simple載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序正確后保存?zhèn)溆?，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD19-HABP4。

1.4 山羊HABP4基因的生物信息學(xué)分析

使用clustalw2 在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)對(duì)本試驗(yàn)克隆獲得的山羊HABP4基因CDS序列與綿羊預(yù)測(cè)序列(XM_004005238.4)、牛(NM_001081523.1)、豬(NM_001244681.1)、人(NM_014282.4)、小鼠(NM_019986.3)和大鼠(NM_001079940.1)的HABP4基因進(jìn)行同源性分析。使用BioXM2.6軟件對(duì)山羊與綿羊(預(yù)測(cè)序列)、牛、人和豬進(jìn)行HABP4基因序列比對(duì)。使用Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)HABP4的氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分析。使用ExPASy ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/)計(jì)算HABP4的疏水性。使用 Tmpred 在線軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。利用EMBL-EBI在線軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用phyre2在線軟件 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2)預(yù)測(cè)山羊HABP4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用Net Phos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)HABP4蛋白的磷酸化位點(diǎn)。使用在線軟件PsortⅡ(https://www.genscript.com/tools/psort)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用 MEGA7.0 軟件對(duì)HABP4 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用STRING在線軟件(https://string-db.org/)預(yù)測(cè)可能與HABP4蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。

1.5 山羊HABP4基因在不同組織的表達(dá)分析

選取10月齡左右健康山羊(n=16)的9個(gè)組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸、瘤胃和胰腺)，分別對(duì)每個(gè)組織提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)“1.3”中克隆的HABP4基因CDS序列，運(yùn)用Primer Premier5設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，RT-qPCR檢測(cè)HABP4基因在各組織中的表達(dá)差異。以實(shí)驗(yàn)室前期保存的Ubiquitously-Expressed Transcript(UXT)基因作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR的反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 6.8 μL，ROX 0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，熔解曲線：95 ℃變性15 s，60 ℃冷卻1 min，使DNA雙鏈充分結(jié)合，最后從60 ℃逐步加熱至95 ℃，每一步增加0.15 ℃并保持1 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)HABP4互作蛋白的mRNA表達(dá)水平

根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與HABP4蛋白發(fā)生相互作用的蛋白為基礎(chǔ)，利用RT-qPCR檢測(cè)與HABP4蛋白發(fā)生相互作用的蛋白的mRNA表達(dá)。各基因引物見(jiàn)表1。RT-qPCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 6.8 μL，ROX 0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循 環(huán)，熔解曲線：95 ℃變性15 s，60 ℃冷卻1 min，使DNA雙鏈充分結(jié)合，最后從60 ℃逐步加熱至95 ℃，每一步增加0.15 ℃并保持1 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Metascape在線分析軟件(http://metascape.org/)對(duì)HABP4進(jìn)行GO功能富集。分析HABP4基因在山羊不同組織中表達(dá)水平時(shí)，采用2-△△Ct方法分析HABP4基因相對(duì)于內(nèi)參基因UXT的表達(dá)差異，其中△Ct=CtHABP4-CtUXT，△△Ct=△Ct組織-△Ct心。計(jì)算結(jié)果在SPSS 22.0中進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。采用2-△Ct方法分析HABP4基因互作蛋白在胰腺中的表達(dá)，其中△Ct=Ct預(yù)測(cè)互作蛋白目的基因-CtUXT。并將計(jì)算結(jié)果在SPSS 22.0中進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 山羊HABP4基因的克隆及鑒定

本試驗(yàn)以山羊組織cDNA為模板，通過(guò)PCR方法成功擴(kuò)增HABP4基因，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)與預(yù)期目的片段大小(1 496 bp)相符合(圖1A)，包含5′UTR 61 bp，CDS區(qū)1 254 bp，3′UTR 181 bp，編碼417個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA。上傳HABP4基因CDS區(qū)序列到NCBI獲得GenBank登錄號(hào)：MW748177。膠回收產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行菌落PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)測(cè)HABP4基因的大小相符合(圖1B)。

A.HABP4基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)；B.重組質(zhì)粒pMD19-HABP4的PCR擴(kuò)增。M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；N.陰性對(duì)照；1～2.HABP4基因的擴(kuò)增條帶；3～6.重組質(zhì)粒pMD19-HABP4擴(kuò)增條帶A.HABP4 gene amplified by PCR;B.Recombinant plasmid pMD19-HABP4 amplified by PCR.M.2 000 bp DNA ladder;N.Negative control;1-2.HABP4 gene amplified by PCR;3-6.Recombinant plasmid pMD19-HABP4 amplified by PCR圖1 HABP4基因克隆及重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 HABP4 gene cloning and recombinant plasmid identification

2.2 HABP4基因的生物信息學(xué)分析

本研究獲得的HABP4基因CDS區(qū)的同源性分析表明，山羊HABP4基因的CDS區(qū)與NCBI中牛(NM_001081523.1)的同源性高達(dá)98.41%，與綿羊預(yù)測(cè)序列(XM_004005238.4)的同源性為100%，與豬(NM_001244681.1)、人(NM_014282.4)、小鼠(NM_019986.3)和大鼠(NM_001079940.1)的同源性分別為94.03%、89.49%、84.64%、85.05%。使用BioXM2.6軟件對(duì)山羊與綿羊(預(yù)測(cè)序列)、牛、豬和人進(jìn)行HABP4基因序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

利用Protparam在線軟件對(duì)克隆獲得的山羊HABP4基因CDS區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其蛋白分子式為C1 957H3 108N638O644S8，分子質(zhì)量為46 134.57 u；理論等電點(diǎn)(theoretical PI)為6.54，不穩(wěn)定指數(shù)為58.05，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。ExPASy ProtScale在線軟件計(jì)算HABP4的疏水性(圖3A)，推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。使用Tmpred Server v.2.0 對(duì)HABP4蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行分析，推測(cè)該蛋白不屬于跨膜蛋白(圖3B)。使用 SIGNALP 4.0分析HABP4蛋白，預(yù)測(cè)該蛋白不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，推測(cè)該蛋白為非分泌性蛋白 (圖3C)。Net Phos 3.1在線軟件預(yù)測(cè)HABP4蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示該蛋白有19個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)，無(wú)O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析顯示，HABP4蛋白主要定位于細(xì)胞核(73.9%)和細(xì)胞質(zhì)(8.7%)中。Phyre2在線軟件對(duì)山羊HABP4蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HABP4蛋白中α螺旋占19%，無(wú)規(guī)則卷曲占83%，β折疊占4%。利用 Phyre2 Server預(yù)測(cè)了山羊HABP4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3D)。同時(shí)分析了與山羊HABP4蛋白氨基酸同源性最高的綿羊(預(yù)測(cè)序列)HABP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3E),分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)物種HABP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，與豬HABP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3F)對(duì)比也無(wú)明顯差異，預(yù)測(cè)其功能具有一定相似性；與牛HABP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3G)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)有差異性，預(yù)測(cè)其功能相似度較低。利用 MEGA7.0軟件構(gòu)建各物種HABP4基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。如圖4A顯示，山羊與牛親緣關(guān)系最近，與豬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與小鼠親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。利用Sting數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到MRPS7、CHD4、UBA52(ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1)、RPL32(ribosomal protein L32)、GNB2L1(guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1,)、RPS9(ribosomal protein S9)、RPS3(ribosomal protein S3,)、RPS16(ribosomal protein S16)、RPL31(ribosomal protein L31,)、RPL38共10個(gè)蛋白可能和HABP4蛋白存在相互作用(圖4B)。

A.山羊HABP4蛋白的疏水性分析；B.山羊HABP4蛋白的跨膜區(qū)分析；C.山羊HABP4蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)；D.山羊HABP4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；E.綿羊HABP4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；F.豬HABP4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；G.牛HABP4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A.Hydrophobicity analysis of goat HABP4;B.Transmembrane region analysis of goat HABP4 protein;C.Predicted signal peptide of goat HABP4 protein;D.Predicted tertiary structure of goat HABP4 protein;E.Predicted tertiary structure of sheep HABP4 protein;F.Predicted tertiary structure of pig HABP4 protein;G.Predicted tertiary structure of cattle HABP4 protein圖3 山羊HABP4蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of goat HABP4 protein

A.HABP4基因進(jìn)化樹(shù)分析；B.與HABP4可能存在互作的蛋白預(yù)測(cè)A.Evolutionary tree analysis of HABP4 gene;B.Prediction of proteins interacting with HABP4 protein圖4 山羊HABP4蛋白的生物信息學(xué)分析Fig4 Bioinformatics analysis of goat HABP4 protein

2.3 山羊HABP4基因不同組織的mRNA表達(dá)水平分析

以UXT為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)山羊9個(gè)不同組織中HABP4基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在山羊的心、肝、脾、肺、腎、胰腺、小腸、大腸和瘤胃等9個(gè)組織中均能檢測(cè)到HABP4基因的mRNA表達(dá)，其中HABP4基因mRNA表達(dá)水平在胰腺中最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)，腎組織次之，肝和瘤胃最低(圖5)。

圖5 HABP4基因mRNA在不同組織中相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of HABP4 mRNA in different tissues

2.4 HABP4互作蛋白預(yù)測(cè)及各基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析

根據(jù)STRING在線軟件預(yù)測(cè)到HABP4蛋白與MRPS7、CHD4、UBA52、RPL32、GNB2L1、RPS9、RPS3、RPS16、RPL31、RPL38共10個(gè)蛋白可能存在相互作用，因此推測(cè)，這些基因可能與HABP4的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性。以UXT為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR檢測(cè)這10個(gè)基因在16只羊胰腺中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果見(jiàn)表2，HABP4與UAB52(r=0.642,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)，與RPL32(r=0.564,P<0.05)、RPS9(r=0.589,P<0.05)具有顯著正相關(guān)性；MRPS7和RPS3(r=0.910,P<0.01)、RPL32(r=0.862,P<0.01)、RPS9(r=0.850,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)，與RPS16(r=0.570,P<0.05)具有顯著正相關(guān)性；CDH4和RPL31(r=0.792,P<0.01)、RPS16(r=0.808,P<0.01)、GNB2L1(r=0.959,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)，與RPS3(r=0.501,P<0.05)具有顯著正相關(guān)性；UBA52與RPL32(r=0.596,P<0.05)具有顯著正相關(guān)性；RPS3與RPS16(r=0.796,P<0.01)、RPL32(r=0.710,P<0.01)、GNB2L1(r=0.653,P<0.01)、RPS9(r=0.672,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)；RPL38和RPL31(r=0.710,P<0.01)具有極顯著正相關(guān),與RPS16(r=0.619,P<0.05)具有顯著正相關(guān)；RPL31與RPL32(r=-0.395,P<0.05)、RPS9(r=-0.399,P<0.05)具有顯著負(fù)相關(guān)；RPS16與RPL32(r=0.298,P<0.01)、RPS9(r=0.277,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)；RPL32與GNB2L1(r=0.021,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)；GNB2L1與RPS9(r=0.040,P<0.01)具有極顯著正相關(guān)，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)基因表達(dá)量之間均具有較強(qiáng)的相關(guān)性，如RPS9與7個(gè)基因具有較強(qiáng)的相關(guān)性，其次RPL32、RPS16、RPS3各與6個(gè) 基因具有較強(qiáng)相關(guān)性，GNB2L1、RPL31、CDH4、MRPS7各與4個(gè)基因具有較強(qiáng)相關(guān)性，UBA52、HABP4各與3個(gè)基因具有較強(qiáng)相關(guān)性，最少的為RPL38與2個(gè)基因具有較強(qiáng)相關(guān)性。

表2 與 HABP4互作蛋白的基因表達(dá)量之間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of genes expression among proteins interacting with HABP4

2.5 HABP4蛋白及相關(guān)性基因的GO功能富集

從2.4結(jié)果中得知HABP4基因與UAB52、RPL32、RPS9共3個(gè)基因具有顯著相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行GO分析，以富集結(jié)果P<0.01 為參考標(biāo)準(zhǔn)。GO 分析包括生物過(guò)程(圖6A)和分子功能(圖6 B)兩個(gè)方面。在生物過(guò)程方面主要涉及細(xì)胞定位、新陳代謝、多生物過(guò)程以及生物過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)；分子功能方面與翻譯起始、核糖體轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)中的代謝有關(guān)。

A.生物學(xué)過(guò)程分析；B.分子功能分析A.Biological process analysis;B.Molecular function analysis圖6 山羊HABP4及相關(guān)基因功能富集分析Fig.6 Functional enrichment analysis of goat HABP4 and related genes

3 討 論

本研究獲得山羊HABP4基因的CDS區(qū)域以及預(yù)測(cè)其生物信息學(xué)相關(guān)信息對(duì)揭示該基因的功能將起到重要的作用。HABP4基因CDS區(qū)為1 254 bp，其中GC含量達(dá)60%以上，由于HABP4基因的GC含量較高，在擴(kuò)增過(guò)程中導(dǎo)致多條非特異性條帶的產(chǎn)生。本試驗(yàn)通過(guò)多次優(yōu)化反應(yīng)條件，同時(shí)使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶(TaKaRa)克隆獲得了條帶單一的PCR產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果表明，本試驗(yàn)克隆得到的HABP4基因的CDS區(qū)與NCBI上公布的牛、豬、人、小鼠、大鼠的同源性分別為98.41%、94.03%、89.49%、86.64%和85.05%，可以看出，HABP4在哺乳動(dòng)物間存在較高的保守性并且與牛的同源性最高。不同的生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)基因功能的結(jié)果可能有所不同，因此，篩選好的生物信息學(xué)分析軟件對(duì)精確預(yù)測(cè)基因功能是至關(guān)重要的。如MHMM-2.0和TMPred兩款在線比對(duì)軟件常用于蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)[18]。本研究采用ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性，發(fā)現(xiàn)采用試驗(yàn)克隆獲得的HABP4基因序列和其氨基酸序列得到不同的結(jié)果，其中基因序列結(jié)果分析顯示為疏水性蛋白，氨基酸序列分析結(jié)果為親水性蛋白。李武峰等[19-21]均采用目的基因的氨基酸序列來(lái)分析該蛋白對(duì)應(yīng)的疏水性。可以看出，利用氨基酸序列分析蛋白的疏水性的可靠度更高。因此，本試驗(yàn)使用HABP4基因的氨基酸序列通過(guò)ProtScale在線軟件，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HABP4蛋白為親水性蛋白。HABP4蛋白不屬于跨膜蛋白，無(wú)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，這也與其在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用的研究結(jié)果是一致的。蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)可為研究HABP4蛋白的活性區(qū)域，并進(jìn)行定點(diǎn)突變具有重要的指導(dǎo)意義，且這些位點(diǎn)常常對(duì)生物進(jìn)化的研究具有重要的參考價(jià)值[22]。蛋白的亞細(xì)胞定位往往能一定程度上反映出該蛋白的生物學(xué)功能[23]。本研究亞細(xì)胞定位分析顯示，HABP4蛋白主要定位于細(xì)胞核(73.9%)和細(xì)胞質(zhì)(8.7%)中，這與Rohde等[24]的研究報(bào)道結(jié)果一致，推測(cè)山羊HABP4蛋白可能與人源HABP4蛋白的功能相似。相互作用蛋白分析顯示，HABP4蛋白可能與MRPS7、CHD4、UBA52等蛋白存在相互作用。

RT-qPCR分析mRNA表達(dá)水平時(shí)，合適內(nèi)參基因的選擇能得到相對(duì)準(zhǔn)確的RT-qPCR數(shù)據(jù)[25]。內(nèi)參基因是一種標(biāo)準(zhǔn)化核酸樣品數(shù)量的基因，從理論上其表達(dá)量應(yīng)保持穩(wěn)定。但有研究得出，常用的內(nèi)參基因存在波動(dòng)性表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)只存在于特定的試驗(yàn)條件、細(xì)胞或組織中[26]，因此，篩選表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因顯得尤為重要[27-28]。常用于研究的內(nèi)參基因主要包括GAPDH、ACTIN、18SrRNA、RPLP0、TBP、UXT等，其中GAPDH長(zhǎng)期作為公認(rèn)的內(nèi)參基因被大家廣泛使用[29]，如2017年，張蓉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH在蛋雞組織表達(dá)中為最優(yōu)選擇的內(nèi)參基因。池永東等[30]報(bào)道，相同的內(nèi)參基因并不適合于所有的物種，且發(fā)現(xiàn)GAPDH基因在山羊組織中并非穩(wěn)定性最強(qiáng)。2013年，Bonnet等[31]研究發(fā)現(xiàn)，UXT、EIF3K和RPLP0基因是?；蛏窖蚋?、肌肉、乳腺和脂肪組織中最為穩(wěn)定的參考基因，可使mRNA豐度正?；?。同時(shí)，2020年，謝光杰等[32]以UXT為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了山羊APOL6基因在簡(jiǎn)州大耳羊 背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪和腹間脂肪的表達(dá)量。許晴等[33-35]在山羊基因功能研究中以UXT為內(nèi)參基因矯正目的基因的表達(dá)。因此，本研究結(jié)合前人研究結(jié)果，選擇UXT作為內(nèi)參基因。

分析基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律可為研究該蛋白的功能提供試驗(yàn)依據(jù)。從山羊HABP4的組織分布來(lái)看，該基因在各組織中均有表達(dá)，其中在胰腺中的表達(dá)量最高，腎組織次之，肝和瘤胃最低。HABP4在各組織間的表達(dá)差異可能和其在不同組織中的功能差異相關(guān)。研究顯示，胰腺一直以一種特殊的實(shí)質(zhì)器官被研究，胰腺的內(nèi)分泌及外分泌功能向來(lái)被認(rèn)為是相互獨(dú)立存在[36],在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA代謝、RNA拼接以及mRNA穩(wěn)定性等過(guò)程中發(fā)揮著作用，而HABP4蛋白同樣在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA代謝等水平發(fā)揮作用，從而推測(cè)HABP4蛋白可能在山羊的胰腺中發(fā)揮著類似重要的生物學(xué)功能。

目前，關(guān)于HABP4蛋白具體與哪種或者哪些蛋白之間相關(guān)性更強(qiáng)的研究較少。參照文獻(xiàn)[37]的方法，本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)可能與HABP4蛋白存在相互作用的10個(gè)蛋白在16只羊胰腺中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平并進(jìn)行GO 功能富集。結(jié)果顯示，HABP4基因和各個(gè)基因之間均具有相關(guān)性，其中主要與UAB52、RPL32、RPS9 3個(gè)基因具有顯著相關(guān)性。UBA52是由N端泛素和C端核糖體蛋白L40組成的融合蛋白[38]。在細(xì)胞內(nèi)，被泛素化修飾的UBA52將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白，使靶蛋白被26S蛋白酶體識(shí)別而降解，從而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)，參與細(xì)胞內(nèi)熱休克反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[39-40]。RPL以及RPS家族作為核糖體的主要成分，在調(diào)控蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起著重要作用[41]。同時(shí)，RPL以及RPS家族還可以參與調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)、凋亡、細(xì)胞增殖和分化、耐藥性、細(xì)胞遷移和侵襲[42]。研究報(bào)道顯示，細(xì)胞內(nèi)RPL32被敲低后會(huì)導(dǎo)致核糖體應(yīng)激，而核糖體是細(xì)胞內(nèi)翻譯的重要細(xì)胞器[43]，直接影響rRNA的成熟[44]。同時(shí)，RPS9蛋白與腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)[45-46]。因而，根據(jù)HABP4蛋白和UAB52、RPL32、RPS9共3個(gè)蛋白相對(duì)表達(dá)的正相關(guān)，推測(cè)HABP4蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯、合成以及細(xì)胞周期、凋亡等方面發(fā)揮一定的調(diào)控作用，具體作用有待進(jìn)一步研究。GO功能富集分析常被用于檢測(cè)差異基因在GO term的富集程度，能一定程度上對(duì)基因的功能進(jìn)行限定和描述[47]。2007年，Uenishi等[48]利用GO功能富集分析了豬源HABP4基因可能存在的分子功能并繪制了樹(shù)形結(jié)構(gòu)圖。本研究通過(guò)GO功能富集發(fā)現(xiàn)，HABP4基因的生物學(xué)過(guò)程分析主要富集于細(xì)胞定位、新陳代謝、多生物過(guò)程以及生物過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)；分子功能方面與翻譯起始、核糖體轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)中的代謝有關(guān)。

4 結(jié) 論

山羊HABP4基因cDNA全長(zhǎng)1 496 bp，包含5′UTR 61 bp，CDS區(qū)1 254 bp，3′UTR 181 bp，編碼417個(gè)氨基酸，在胰腺中表達(dá)水平最高。HABP4與UAB52表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，與RPL32、RPS9呈顯著正相關(guān)，推測(cè)其在細(xì)胞定位、新陳代謝、多生物過(guò)程及生物過(guò)程負(fù)調(diào)節(jié)以及翻譯起始、核糖體轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)中的代謝等方面發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步探討HABP4在調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用提供了數(shù)據(jù)參考。