多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織轉(zhuǎn)錄組分析

劉天義，馮 卉，Salsabeel Yousuf，解領(lǐng)麗，苗向陽

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

綿羊是全世界主要的肉、奶、皮毛的牲畜資源。羊肉是我國日常膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)于羊肉品質(zhì)的要求也隨之提高，而脂肪含量對(duì)肉品質(zhì)具有重要影響[1-2]。研究脂肪組織的脂肪沉積機(jī)制不僅可以為人們提供高品質(zhì)肉產(chǎn)品，還可以提高養(yǎng)殖業(yè)飼料轉(zhuǎn)化率，避免浪費(fèi)。同時(shí)通過對(duì)脂肪組織的研究還能為由肥胖引起的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供一定依據(jù)[3-5]。

脂肪組織遍布哺乳動(dòng)物全身，主要分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織兩類[6-7]。研究表明，脂肪合成與分解代謝過程受到C/EBPs、PPARγ、BMP4等轉(zhuǎn)錄因子[8-10]，以及PPAR、MAPK、TGFβ、Insulin等信號(hào)通路的調(diào)控[11-12]。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SCD、FAS、FAP4等基因在脂肪酸代謝過程中發(fā)揮作用，其中，SCD1是SCD的一種亞型，可作為脂肪沉積的潛在標(biāo)志物，SCD1是SREBP1調(diào)控的下游基因，當(dāng)SCD1的啟動(dòng)子上的固醇調(diào)節(jié)原件與SREBP1c轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后上調(diào)轉(zhuǎn)錄，脂質(zhì)合成增加[14]。RNA是遺傳信息的重要載體，mRNA可以編碼蛋白實(shí)現(xiàn)遺傳信息的傳遞，lncRNA和miRNA均可以靶向mRNA來調(diào)控基因的表達(dá)[15-17]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)由于具有高靈敏度，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。Miao等[18]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段，對(duì)多塞特羊與小尾寒羊脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以更好地了解兩品種綿羊脂肪代謝的生物學(xué)機(jī)制。Huang等[19]通過對(duì)和牛與荷斯坦牛皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選得到差異表達(dá)基因，進(jìn)一步對(duì)兩品種牛脂肪沉積的分子機(jī)制進(jìn)行解析。為更深入了解mRNA在綿羊脂肪組織中的作用，本研究選用脂肪沉積存在差異的多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織為試驗(yàn)材料，其中多浪羊脂臀較大，屬于肉脂兼用型綿羊，小尾寒羊?qū)儆诙淌菸残途d羊，肉用性能較差，皮下脂肪較少，而脂肪主要分布在內(nèi)臟周圍，以此來適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件，二者為研究脂肪的沉積機(jī)制提供了良好的試驗(yàn)材料。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)較為成熟，以往雖有通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來對(duì)脂肪組織進(jìn)行的研究報(bào)道，但對(duì)于多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織沉積的生物學(xué)差異還有待于深入研究。

本研究通過對(duì)多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到兩品種羊皮下脂肪組織中差異表達(dá)的mRNA，并從中篩選出與脂肪沉積相關(guān)的候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品制備

本試驗(yàn)以脂肪沉積存在差異的多浪羊和小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，選取健康無病、體況良好，種內(nèi)個(gè)體體重相近(約50 kg)的雌性成年多浪羊和小尾寒羊各3只。采集背最長(zhǎng)肌皮下脂肪組織為試驗(yàn)材料，迅速將皮下脂肪組織放入液氮凍存。該過程使用已消毒器械，減少RNA的降解。試驗(yàn)設(shè)置多浪羊皮下脂肪組織和小尾寒羊皮下脂肪組織兩組樣本，每組樣本3個(gè)重復(fù)，分別為D-PF-1、D-PF-2、D-PF-3、X-PF-1、X-PF-2、X-PF-3。

1.2 方法

1.2.1 脂肪組織RNA的提取及質(zhì)控 取適量的脂肪組織，采用TRIzol(Invitrogen)法提取脂肪組織中的總RNA。并使用DNase I (RNase-free，TaKaRa)去除DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳與ND-2000(NanoDrop Technologies)對(duì)所提RNA的濃度、純度以及完整性進(jìn)行初步檢測(cè)，再用2100 Bioanalyzer(Agilent)進(jìn)行檢測(cè)，記錄OD260 nm/OD280 nm以及RIN值。

1.2.2 脂肪組織cDNA文庫構(gòu)建和RNA測(cè)序 將質(zhì)檢合格的總RNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。采用TruSeqTMstranded total RNA Kit(Illumina，San Diego，CA)試劑盒。首先從2 μg總RNA中除去rRNA；加入Fragmentation Buffer將RNA片段化；采用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen,CA)試劑盒，加入六堿基隨機(jī)引物(Illumina)，利用隨機(jī)引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，隨后合成第二鏈cDNA，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)；加入End Repair Mix將粘性末端補(bǔ)成平末端，隨后在3′末端加上一個(gè)A堿基，用于Y字形的接頭，擴(kuò)增前用UNG酶消化cDNA第二鏈；cDNA 經(jīng)過 PCR 富集(sample preparation Kit(Illumina，San Diego,CA)后，DNA clean beads篩選 200～300 bp 的條 帶。經(jīng) TBS380(Picogreen)定量后，文庫使用 Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 脂肪組織mRNA測(cè)序分析 為保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，需要使用fastp[20]軟件(https://github.com/OpenGene/fastp)將原始數(shù)據(jù)(raw data)中包含的測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、不確定堿基信息率較高序列及長(zhǎng)度過短序列進(jìn)行過濾，從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean data)。隨后使用Hisat2[21](https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)將篩選后的數(shù)據(jù)定位到參考基因組，獲取用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，同時(shí)將對(duì)比的結(jié)果用分析軟件RSeQC-2.3.6[22-23]進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。在已有的參考基因組基礎(chǔ)上使用軟件stringTie[24-25](https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行組裝拼接，與已有的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，獲得沒有注釋的新轉(zhuǎn)錄本。用軟件RSEM[26-27](http://deweylab.github.io/RSEM/)進(jìn)行mRNA的表達(dá)量計(jì)算，再用軟件DESeq2篩選樣本之間差異表達(dá)的mRNA，將條件設(shè)定為|Fold change|≥2，Padjust≤0.05進(jìn)行篩選。

1.2.4 脂肪組織差異表達(dá)mRNA功能富集分析 應(yīng)用Cytoscape中的Clue-GO[28]軟件將差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，GO是基因本體論聯(lián)合會(huì)建立的數(shù)據(jù)庫(geneontology，http://geneontology.org/)，分為細(xì)胞組分(cellular component，CC)，分子功能(molecular function，MF)和生物學(xué)過程(biological process，BP)。KEGG[29]京都基因和基因組百科全書(https://www.genome.jp/kegg/)是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的數(shù)據(jù)庫，可將基因按照參與的pathway通路或行使的功能分類。將集中的基因顯示在KEGG通路圖上，展示其參與的KEGG注釋通路圖。利用多重檢驗(yàn)校正方法BH(Benjamini and Hochberg)對(duì)P值進(jìn)行校正，當(dāng)P值(Padjust)小于等于0.05時(shí)則顯著富集。

1.2.5 脂肪組織mRNA蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析 將GO和KEGG注釋得到的信息，結(jié)合文獻(xiàn)篩選出與脂肪發(fā)育相關(guān)的條目和信息通路，選擇其中涉及到的基因，利用Cytoscape[30]軟件制作網(wǎng)絡(luò)圖，找出網(wǎng)絡(luò)中處于節(jié)點(diǎn)位置的比較重要的基因，在文獻(xiàn)中找出這些基因具體的功能以及在脂肪組織發(fā)育中的作用。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因的表達(dá)水平。利用PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒在LightCycler480 Ⅱ Real-time PCR Instrument(Roche，Swiss)上配置PCR反應(yīng)體系：2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各 0.2 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 3.6 μL。PCR程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每1 ℃采集5次熒光信號(hào)。利用2-ΔΔCt法進(jìn)行樣本間表達(dá)量的計(jì)算[31]，用t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”，P<0.05為差異顯著。對(duì)應(yīng)的引物序列見表1。

表1 基因以及對(duì)應(yīng)的引物Table 1 Gene and the corresponding primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)總條目數(shù)(raw reads)中質(zhì)檢不合格的條目去除后得到質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù)的總條目數(shù)(clean reads)，多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織clean reads分別為135 393 598、140 587 412、142 895 188、136 746 686、128 433 640和130 999 204。將這些reads與參考基因組對(duì)比得到有效數(shù)據(jù)(mapped reads),以及在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的clean reads數(shù)目(multiple mapped)和唯一比對(duì)位置的clean reads數(shù)目(unique mapped)見表2。Mapping率高于94%，說明參考基因組注釋完整，且相關(guān)試驗(yàn)不存在污染情況，為后續(xù)數(shù)據(jù)分析做了很好的鋪墊。

表2 6個(gè)樣本比對(duì)參考基因組結(jié)果Table 2 The result of 6 samples after mapping to the reference genome

2.2 已知與新mRNA分析及表達(dá)量計(jì)算

將數(shù)據(jù)進(jìn)行已知和新mRNA篩選，結(jié)果顯示，在多浪羊和小尾寒羊皮下脂肪組織樣本中已知和新mRNA的數(shù)量分別為38 672和1 606個(gè)。每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算mRNA的表達(dá)量，選取|Fold change|≥2，Padjust≤0.05作為篩選差異表達(dá)mRNA的閾值。發(fā)現(xiàn)兩組差異表達(dá)的mRNA共839個(gè)(已知mRNA 828個(gè)，新mRNA 11個(gè))，如圖1所示，其中在多浪羊組中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目分別為320和519個(gè)。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

2.3 脂肪組織差異表達(dá)mRNA的功能富集分析

對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO和KEGG分析。GO注釋結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程中，差異表達(dá)的mRNA主要富集于脂質(zhì)分解代謝過程、脂質(zhì)生物合成過程、脂質(zhì)分解代謝負(fù)調(diào)控過程、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控、低密度脂蛋白顆粒介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、對(duì)甘油三酯的反應(yīng)、脂質(zhì)代謝過程、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)負(fù)調(diào)控等條目；在分子功能方面，主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、心磷脂結(jié)合、甘油酸激酶活性、磷脂酰甘油結(jié)合等條目；在細(xì)胞組分，主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)、脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒等條目(圖2)。在KEGG通路富集中也富集到與脂代謝相關(guān)的通路，如PI3K-Akt、MAPK、胰島素以及PPAR等信號(hào)通路(圖3)。

圖2 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of the differentially expressed genes

圖3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of the differentially expressed genes

2.4 脂肪組織差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

構(gòu)建與脂質(zhì)代謝相關(guān)差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，能夠更直觀的展示多浪羊和小尾寒羊與脂肪沉積相關(guān)的基因間的調(diào)控關(guān)系(圖4)。本研究以網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的聯(lián)通性(Degree)為依據(jù)，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[32-33]。Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大，表明該節(jié)點(diǎn)越關(guān)鍵。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，COL1A1、AKT3、AKT2、COL1A2、COL3A1等基因編碼的蛋白處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，可能在皮下脂肪代謝和成脂分化中具有重要調(diào)控作用。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)選擇6個(gè)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，MGST3、COL1A1、AKT3在多浪羊皮下脂肪組織中下調(diào)，PCK1、PPP2R5A、LOC101113583在多浪羊皮下脂肪組織中顯著上調(diào)。以上結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，表明測(cè)序結(jié)果可靠。

圖5 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 qRT-PCR validation for differentially expressed genes

3 討 論

mRNA是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的模板，在生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[34]，可為培育優(yōu)質(zhì)畜禽品種以及研究和預(yù)防與脂代謝相關(guān)的疾病提供依據(jù)。本研究對(duì)多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織中的mRNA進(jìn)行測(cè)序和分析，共鑒定到38 672個(gè)mRNAs，其中差異表達(dá)的mRNAs共839個(gè)，在多浪羊中有320個(gè)上調(diào)表達(dá)，519個(gè)下調(diào)表達(dá)。通過qRT-PCR對(duì)MGST3、COL1A1、AKT3、PCK1、PPP2R5A、LOC101113583進(jìn)行了驗(yàn)證，與測(cè)序結(jié)果一致，表明測(cè)序結(jié)果可靠。

有研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)可以影響脂肪的形成，而膠原是脂肪細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，對(duì)脂肪的形成具有一定的調(diào)節(jié)作用[35]，推測(cè)研究編碼膠原的基因COL1A1對(duì)于脂肪的沉積具有重要意義。在秦川牛中的研究表明，COL1A1的表達(dá)量與肉質(zhì)存在一定的相關(guān)性[36]。COL1A1在高脂飲食的肥胖人皮下脂肪組織中和高脂飼喂小鼠肌腱內(nèi)的表達(dá)量均降低[37-38]，與本研究趨勢(shì)一致，表明COL1A1可能參與了脂肪代謝的調(diào)控。本研究中，AKT2顯著富集于PI3K/Akt信號(hào)通路中。PI3K/Akt是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的主要通路，通過調(diào)控胰島素水平參與糖脂代謝，可以抑制脂類分解。AKT2是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶，僅在胰島素靶組織中高表達(dá)，包括脂肪、肝、肌肉等組織，而胰島素可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，即推測(cè)AKT2基因可能調(diào)控了脂肪細(xì)胞的分化。敲除AKT2基因的小鼠表現(xiàn)出脂肪組織減少、胰島素抵抗和輕度糖尿病等現(xiàn)象[39]，本研究中，AKT2在多浪羊皮下脂肪組織中高表達(dá)，表明AKT2基因?qū)Χ嗬搜蛑惣?xì)胞分解具有促進(jìn)作用。綜上所述，COL1A1與AKT2不僅在脂肪沉積過程中起到了調(diào)控作用，而且還可能成為治療糖尿病等相關(guān)代謝疾病的潛在靶基因。

節(jié)點(diǎn)的大小代表連通性大小，白色表示下調(diào)，灰色表示上調(diào)The size of the node represents the level of Degree,white means down-regulation and gray means up-regulation圖4 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of differentially expressed gene proteins interaction

通過差異表達(dá)基因GO注釋和KEGG富集分析表明，差異表達(dá)基因主要參與了PPAR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、脂質(zhì)代謝過程等與脂類代謝相關(guān)的生物學(xué)過程。本研究鑒定到SCD、LPL、PCK1、PPP2R5A等基因與脂類代謝、脂類生物合成過程以及胰島素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路過程相關(guān)。PPAR信號(hào)通路是與脂肪酸的生物合成和代謝以及成脂分化相關(guān)的通路[40-41]，本研究中，PPAR信號(hào)通路顯著富集了10個(gè)差異表達(dá)基因，其中SCD、LPL和PCK1在多浪羊皮下脂肪組織中上調(diào)表達(dá)，SCD是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合酶，是參與單不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶，并且具有多種亞型。由于PPARγ2對(duì)于甘油三酯合成以及脂肪酸吸收的相關(guān)基因具有調(diào)控作用，所以在脂質(zhì)代謝過程中具有重要作用，SCD1可以作為其靶基因在脂代謝過程中發(fā)揮作用。SCD1的表達(dá)水平受類固醇激素、甲狀腺激素、共軛亞油酸等影響。LPL是脂肪分解的關(guān)鍵限速酶，有利于脂肪的沉積[42-45]，并且主要在轉(zhuǎn)錄后蛋白水平起作用。LPL作為脂肪細(xì)胞的特征蛋白質(zhì)之一，在脂肪細(xì)胞分化過程中具有重要作用，可以充當(dāng)前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過程的標(biāo)志。本研究中，LPL在多浪羊皮下脂肪組織中上調(diào)表達(dá)，與前人研究結(jié)果一致，推測(cè)LPL同樣對(duì)綿羊脂肪的生成具有促進(jìn)作用。PCK1是調(diào)節(jié)糖異生和甘油生成的主要酶之一[46]，與肥胖相關(guān)，能通過GTP催化草酰乙酸(oxaloacetic acid，OAA)生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)、GDP以及二氧化碳，在甘油生成以及糖異生過程中均可見到。在白色脂肪組織中，PCK1可以調(diào)節(jié)游離脂肪酸酯化生成甘油三酯，PPARγ是其啟動(dòng)子中的結(jié)合位點(diǎn)，與野生型小鼠相比，PPAR缺失小鼠患有嚴(yán)重胰島素抵抗[47]，還有研究表明，敲除小鼠PCK1基因會(huì)導(dǎo)致糖尿病以及肥胖等[48]。因此PCK1對(duì)于維持脂質(zhì)代謝至關(guān)重要。

PPP2R5A是蛋白磷酸酶2A的一個(gè)亞單位，與細(xì)胞增殖分化相關(guān),可以通過調(diào)節(jié)CDK1/2和CHK2的活性促進(jìn)有絲分裂，并且可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)激酶的活性[49-50]。本研究中，PPP2R5A在多浪羊皮下脂肪組織中上調(diào)，GO注釋發(fā)現(xiàn)其主要參與了細(xì)胞過程和脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)。PPP2R5A顯著富集于PI3K-Akt信號(hào)通路，這是細(xì)胞內(nèi)重要的通路，可以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、分化等過程，因此推測(cè)PPP2R5A可能在脂肪細(xì)胞增殖分化等過程中發(fā)揮作用。MGST3與LOC101113583在脂肪沉積的研究中較為少見，但在本研究中顯著富集到脂質(zhì)生物合成與代謝生物學(xué)過程中，對(duì)其功能的研究還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究對(duì)多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪組織中差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，這些差異表達(dá)基因可能參與脂代謝過程，并且從中篩選到影響脂肪沉積的候選基因以及相關(guān)通路。但對(duì)于篩選到的候選mRNA在生物學(xué)功能以及調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)還需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究鑒定分析了多浪羊和小尾寒羊皮下脂肪組織中mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的mRNAs共839個(gè)，在多浪羊皮下脂肪組織中320個(gè)上調(diào)，519個(gè)下調(diào)；通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選出COL1A1、AKT2、SCD、LPL、PCK1與PPP2R5A等與綿羊脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，這些結(jié)果可為進(jìn)一步理解多浪羊與小尾寒羊皮下脂肪沉積與脂代謝差異機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。