高效液相色譜法測定雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量前處理方法的優(yōu)化

陳 薔，達列亞·阿合買提，張崇威，司慧民，張 磊，宋志超*

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.新疆獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063)

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones)是一類人工合成的廣譜殺菌性抗菌藥物，因其具有廣譜、高效、低毒以及與其它抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，已廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。但人們?nèi)糸L期使用含較低濃度氟喹諾酮類藥物的動物食品后，易誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生[1-2]。目前，雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法有液質(zhì)聯(lián)用法[3-5]、液相色譜法[6-8]、酶聯(lián)免疫法[9]等，其中一些是現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)[5-7]。在日常檢測中，采用國內(nèi)農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006和NY 5039-2005的方法對雞蛋中4種氟喹諾酮類藥物檢測時發(fā)現(xiàn)回收率較低且平行性較差。本實驗結(jié)合幾種常見的氟喹諾酮類藥物檢測標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化了樣品提取凈化條件，建立了雞蛋中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星4種氟喹諾酮類藥物多殘留的液相色譜-熒光檢測器分析方法。本方法檢測結(jié)果靈敏度高、準(zhǔn)確度好，適用雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的分析檢測。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料 高效液相色譜儀Waters2695(配熒光檢測器2475)，美國Waters公司；分析天平(感量0.00001 g)，METTLE TOLEDO XP205；天平(感量0.01 g)，ALC-1100；渦旋混合器，IKA MS2；振蕩器，江蘇金壇市正基儀器有限公司HZ-82；離心機， Sigma公司3-30 K；C18固相萃取柱，美國Agilent公司，規(guī)格100 mg，3 mL。

1.2 試劑 乙腈、甲醇均為色譜純；氫氧化鈉、磷酸、三乙胺、磷酸二氫鉀、正己烷為分析純； 實驗用水為高純水；鹽酸環(huán)丙沙星、甲磺酸達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度≥99%)。

1.3 試劑的配制 5.0 mol/L氫氧化鈉溶液， 取氫氧化鈉20 g或飽和溶液28 mL，加水稀釋至100 mL；0.03 mol/L氫氧化鈉溶液，取5.0 mol/L氫氧化鈉溶液0.6 mL，加水稀釋至100 mL；磷酸鹽緩沖液，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水使溶解并稀釋至500 mL(pH≈4.4)，用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0；0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液，取85%磷酸3.4 mL，用水稀釋至1000 mL(pH≈1.7)，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.4)。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：XBridgeTMC18(5 μm，4.6×150 mm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺-乙腈(87+13)；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長450 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別稱取4種氟喹諾酮類藥物對照品，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液配制成濃度分別為1 mg/mL(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星)和0.2 mg/mL(達氟沙星)的標(biāo)準(zhǔn)貯備液； 用流動相稀釋成濃度分別為2、5、10、20、50、100、200 ng/mL(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星)和0.4、1、2、4、10、40 ng/mL(達氟沙星)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.3 樣品前處理 雞蛋去殼，混合均勻。-20 ℃以下貯存?zhèn)溆?。稱取新鮮或解凍的試料2±0.02 g置50 mL離心管中，加入磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋混合，中速振蕩10 min，10000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于25 mL容量瓶中。用磷酸鹽緩沖液10 mL重復(fù)提取一次。合并兩次上清液，定容，混勻，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中。加入正己烷10 mL，渦旋混合，中速振蕩5 min。10000 r/min離心10 min，吸取下層清液備用。C18固相萃取柱依次用甲醇2 mL，磷酸鹽緩沖液2 mL預(yù)洗。取上述備用液10.0 mL以1 mL/min的速度過柱。用水2 mL洗柱，擠干。用洗脫液2.0 mL以1 mL/min的速度將樣品洗脫入10 mL離心管中，擠干，渦旋混合，過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜-熒光檢測器測定。

1.4.4 樣品回收率與精密度 取空白樣品，分別添加5、10、20、50 μg/kg(環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星)和1、2、4、10 μg/kg(達氟沙星)4個濃度，按1.4.3項進行測定。每個濃度分別測定6次，連續(xù)測定4 d，計算回收率及批內(nèi)批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.5 檢測限 取20個空白樣品進行適當(dāng)濃度的添加，按上述步驟操作，測得噪音信號的平均值，按信噪比≥3為檢測限。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離與測定 圖1 為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，4種氟喹諾酮類藥物的保留時間依次為環(huán)丙沙星5.5 min、達氟沙星6.6 min、恩諾沙星7.7 min、沙拉沙星12.1 min。圖2、圖3分別為雞蛋空白樣品、空白添加樣品的色譜圖。

圖1 2 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中氟喹諾酮類藥物色譜圖Fig 1 Chromatogram of standard solution of fluoroquinolones

圖2 空白雞蛋中氟喹諾酮類藥物色譜圖Fig 2 Chromatogram of fluoroquinolones in blank egg

圖3 5 μg/kg空白雞蛋添加試樣中氟喹諾酮類藥物色譜圖Fig 3 Chromatogram of fluoroquinolones with 5 μg/kg added to blank egg

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的色譜條件下，配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.4.3項)進行色譜分析，4種氟喹諾酮類藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

表1 4種氟喹諾酮類藥物測定的工作曲線Tab 1 Standard curves of 4 fluoroquinolones

圖4 4種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard curves of 4 fluoroquinolones

2.3 回收率與精密度 用空白雞蛋添加后進行方法回收率試驗，結(jié)果見表2。由表2可見4種氟喹諾酮類藥物均具有良好的回收率和重現(xiàn)性。

表2 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留回收率試驗及批內(nèi)批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 2 Recoveries of fluoroquinolone Remained in Eggs and the Intra-batch and Inter-batch RSDs

化合物Compound添加濃度Add concentration/(μg·kg-1)測定次數(shù)Number of determinations平均回收率/%Average recovery批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差I(lǐng)ntra-assay coefficientof variation/%(n=6)批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差I(lǐng)nter-assay coefficient ofvariation/%(n=4)恩諾沙星Enrofloxacin5102050123412341234123492.090.194.484.992.893.394.392.091.691.694.590.988.488.493.986.02.35.54.54.62.63.53.51.91.21.62.34.11.12.82.83.54.51.01.73.8沙拉沙星Sarafloxacin5102050123412341234123494.092.395.285.196.095.895.589.196.996.797.793.494.092.894.089.33.95.73.64.82.71.83.74.61.41.41.52.42.62.13.83.25.03.52.02.4

2.4 檢測限 本方法的檢測限為環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星5 μg/kg，達氟沙星1 μg/kg。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取條件的選擇 目前，雞蛋中氟喹諾酮類藥物的提取液有乙腈[3]、甲酸乙腈溶液[8]、EDTA-Mcllvaine緩沖溶液[5]、磷酸鹽緩沖溶液[6-7]等。采用乙腈或酸化乙腈提取均需要增加濃縮步驟，較為繁瑣，而EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制也較為復(fù)雜，故本實驗借鑒文獻[6-7]的提取方法，采用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)對雞蛋中氟喹諾酮類藥物進行提取。本實驗對振蕩時間、提取次數(shù)進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品提取的振蕩時間大于10 min，4種氟喹諾酮類藥物的回收率無明顯變化。用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)提取2次比提取1次回收率提高9.8% ～15.6%，提取3次后，回收率無明顯增加。此外，由于雞蛋中含有大量水分，提取時與提取液混合在一起，用加入的提取液體積來計算結(jié)果會引起較大偏差，所以本實驗采用用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)提取2次，合并后定容的方法準(zhǔn)確定量提取液體積。

3.2 脫脂條件的選擇 由于雞蛋中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)及氨基酸等組分，樣品的提取液呈渾濁狀，高速離心無法使其澄清。所以，在固相萃取前應(yīng)先進行脫脂。本實驗考察了不同體積、不同次數(shù)的正己烷脫脂效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用10 mL正己烷脫脂1次即能達到脫脂效果。需要注意的是，加入正己烷振蕩離心后正己烷和提取液會產(chǎn)生乳化，形成凝絮狀物質(zhì)，低速離心往往使正己烷、乳化層、提取液層分層不明晰，采用高速(10000 r/min)離心10 min可改善分層現(xiàn)象。然而，用吸管不易吸取凝絮狀物質(zhì)，所以，可用吸管小心吸取下層清液備用。

3.3 固相萃取條件的選擇 本實驗采用3 mL C18固相萃取柱凈化，比1 mL C18固相萃取柱能有效減少堵塞現(xiàn)象發(fā)生。首先用2 mL甲醇活化柱子，盡可能除去填料中存在的雜質(zhì)，使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。再用2 mL磷酸鹽緩沖溶液平衡，為上樣創(chuàng)造一致的溶劑環(huán)境。本實驗比較了5、10、15、20 mL4種上樣體積的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 mL和10 mL上樣量的回收率無明顯差異，但對于的低殘留樣品，采用5 mL上樣凈化時最終上機測試溶液的濃度較低，靈敏度不能滿足需要；而當(dāng)上樣體積增加到15 mL以上后會出現(xiàn)不同程度的過柱緩慢甚至堵塞現(xiàn)象，回收率有所降低。所以，最終選擇取備用液10 mL進行凈化。之后用2 mL水淋洗固相萃取柱，除去其中的干擾物。淋洗完后，擠干固相萃取柱，盡可能除去柱中的殘留液體，再用2 mL 0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺(pH 2.4)-乙腈(82+18)即可完全洗脫。本實驗比較了不同體積、不同洗脫液組成比例的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 mL 0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺(pH 2.4)-乙腈(82+18)洗脫不完全，若增大乙腈比例，雖然可以提高洗脫效率但會引起色譜峰展寬。

3.4 方法比較 在空白雞蛋中添加環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星20 μg/kg和達氟沙星4 μg/kg，采用該方法與常用標(biāo)準(zhǔn)進行比較，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同方法測定雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的比較Tab 3 Comparison of Different Methods for Testing of Fluoroquinolone Drugs Residues in Eggs

結(jié)果顯示：采用農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006的檢測方法平均回收率低，原因在于合并提取液后脫脂時正己烷和提取液形成凝絮狀沉淀，除去沉淀后損失部分提取液，致使凈化液體積減少。按照公式A·Cs·V/As/m計算，凈化液與提取液體積不相等，樣品最終的稀釋體積產(chǎn)生偏差。而且，對于不同的樣品，視其脂肪等雜質(zhì)含量的高低，形成的凝絮狀沉淀量不同，損失的提取液體積也不盡相同，其回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也較大。

采用NY 5039-2005附錄A的方法回收率較低的主要原因是2次提取合并后雞蛋中本身的水分進入提取液，影響提取液的體積，且不同的樣品水分有所差別，致使提取液體積無法準(zhǔn)確計量，按照公式A·Cs·V提取·V洗脫/As/m/V凈化計算，樣品提取液體積V1應(yīng)為20 mL，實際值一般有24 mL左右，所以按加入的提取液體積計算的回收率結(jié)果會較低，且對于水分不同的樣品，它們之間的回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也較大。

采用本實驗方法，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿意，提取后定容可以視為提取液體積為25 mL，脫脂后雖然提取液有損失，但取部分脫脂后的提取液凈化，其提取液、凈化液和定容液的體積均準(zhǔn)確，按照公式A·Cs·V提取·V洗脫/As/m/V凈化計算，結(jié)果準(zhǔn)確，回收率穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小。將稱樣量增大至5 g時，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也均較滿意，但由于增加樣品的稱樣量，其脂肪等雜質(zhì)的含量也相應(yīng)提高，一般需要進行2次脫脂，增加了實驗步驟，故舍去該方法。

本研究通過優(yōu)化前處理方法，建立起了液相色譜-熒光法同時檢測雞蛋中4種氟喹諾酮類藥物的方法，該方法線性范圍寬，靈敏度高，重復(fù)性好，可滿足日常樣品的檢測需求，完全適合雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。