干性年齡相關性黃斑變性免疫學機制的研究進展

孟 歡，金 明

?KEYWORDS:age-related macular degeneration; immune molecule; pathogenesis

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種致盲性眼底病變，可導致中心視力不可逆的喪失，是目前發(fā)達國家中老年人失明的主要原因，預計至2040年全球ARMD患者將增至約2.88億[1]，造成嚴重的經(jīng)濟及社會負擔。ARMD根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為滲出型(濕性)及萎縮型(干性)兩型，其中干性ARMD的患者比例約占所有ARMD患者的85%以上[2]，早期以黃斑部色素異常與玻璃膜疣生成為主要表現(xiàn)，而逐步進展至密集或融合的玻璃膜疣乃至晚期視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)局灶性萎縮、光感受器喪失，也稱為地圖樣萎縮(geographic atrophy，GA)[3]。目前ARMD具體的發(fā)病機制尚不完全明確，越來越多的研究表明ARMD是一種多因素導致的退行性眼底病變，涉及遺傳和環(huán)境因素之間的相互作用[4]。但人們普遍認為炎癥與免疫反應在ARMD的發(fā)病中起到關鍵作用[5]，近年來有證據(jù)表明補體、模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)、炎癥小體及多種細胞因子等免疫分子參與了干性ARMD的發(fā)病機制。因此，本文將就上述免疫分子在干性ARMD發(fā)生發(fā)展過程中的作用進行綜述，以探討關于干性ARMD的免疫學發(fā)病機制。

1補體系統(tǒng)

補體是人和脊椎動物血清與組織液中一類經(jīng)活化后具有生物活性、可介導免疫和炎癥反應的蛋白質(zhì)，補體系統(tǒng)是一個復雜的固有免疫監(jiān)視系統(tǒng)，在防御病原體和維持體內(nèi)平衡方面發(fā)揮重要作用[6-7]。補體蛋白以級聯(lián)方式協(xié)同作用，在不同情況下通過三種不同方式啟動—經(jīng)典途徑、凝集素途徑及旁路途徑。補體在體內(nèi)效應十分廣泛，參與調(diào)節(jié)感染及炎癥反應、免疫基因的表達、免疫穩(wěn)態(tài)的維持等多項病理生理過程，幾乎參與了免疫反應的每一步，是連接固有免疫與適應性免疫的重要橋梁[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，補體基因的多態(tài)性與ARMD易感性的關系密切。補體因子H(CFH)是最早被發(fā)現(xiàn)與ARMD發(fā)病相關的補體因子，CFH是補體旁路途徑的主要抑制劑，抑制了C3轉(zhuǎn)化酶的形成和活性，可增強RPE抗氧化應激的能力，但其基因Y402H的多態(tài)性降低了CFH中和氧化脂質(zhì)的能力，顯著增加了患ARMD的風險[11-12]。隨后，補體因子B(CFB)、補體因子I(CFI)、C3、C5等多種補體基因的單核苷酸多態(tài)性與ARMD易感性的關聯(lián)也逐漸得到證實[13-14]。一項包含53 774例ARMD患者和56 973名健康對照者的Meta分析結果顯示，C2、CFB和CFH的部分基因多態(tài)性對ARMD的發(fā)展具有保護作用，而C3的基因多態(tài)性表現(xiàn)為ARMD的高危因素[15]。

補體蛋白自身也參與ARMD的病理過程，補體系統(tǒng)有規(guī)律的活化對RPE有一定保護作用[16]，其異常激活是ARMD的關鍵發(fā)病機制。Nashine等[17]研究發(fā)現(xiàn)ARMD患者的RPE中補體抑制因子的基因和蛋白表達顯著降低，而激活因子水平顯著升高。Toomey等[18]發(fā)現(xiàn)向干性ARMD模型小鼠全身注射C5a抗體，可抑制單核巨噬細胞向RPE的募集，但無法改善小鼠眼底的ARMD樣改變，提示C5a參與干性ARMD的病理過程，但此過程同時還包含多種因素驅(qū)動。目前在玻璃膜疣中已檢出CFH、CFB、C3、C5、C6、C7、C8、C9等多種補體蛋白成分，表明在干性ARMD視網(wǎng)膜上存在由補體系統(tǒng)介導的炎癥反應[19]，而CFH、CFB及C3等因子的存在說明了補體旁路途徑的激活在其中發(fā)揮了明顯作用[20]。不斷發(fā)生的補體旁路途徑的激活，導致膜攻擊復合物(MAC)在脈絡膜毛細血管和RPE上的大量沉積[21]，MAC是三條補體激活途徑的共同末端通路，是補體溶細胞生物學效應的效應復合體，可導致細胞死亡。Mullins等[22]對117例青年、老年供眼進行MAC含量檢測，發(fā)現(xiàn)MAC含量隨年齡及患ARMD顯著增加，在ARMD患眼中發(fā)現(xiàn)硬性玻璃膜疣中除MAC外還存在MAC抗體，而較大或已融合的玻璃膜疣中則未檢出MAC抗體?；诖?，多項作用于補體系統(tǒng)的干性ARMD治療藥物臨床研究正在開展[23-24]。

2模式識別受體

模式識別受體(PRR)是固有免疫系統(tǒng)中可識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern， PAMP)，如脂多糖、膚聚糖或病毒RNA，以及危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)，從而激活一系列免疫通路，引發(fā)免疫反應的受體[25-26]，主要包括Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、核苷酸寡聚結合域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、視黃酸誘導基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptor，RLR)、C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLR)和黑素瘤缺乏因子-2樣受體(absent in melanoma-2-like receptor，ALR)等[27]。

NLR與干性ARMD的關系多通過炎癥小體的激活來實現(xiàn)，除此之外目前被發(fā)現(xiàn)與干性ARMD發(fā)病相關的PRR主要是TLR。TLR是一類膜結合的PRR家族，通過對核因子κB(NF-κB)信號的激活和觸發(fā)炎癥反應細胞因子的釋放介導免疫反應。TLR家族1～7、9、10在RPE上均有表達，其中TLR1和TLR3表達最高[28]。TLR3的激活具有細胞毒性，但Patel等[29]發(fā)現(xiàn)在氧化應激存在的情況下，TLR3的激活顯著提高了RPE細胞的活性，保護其免受氧化應激誘導的死亡，這可能和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)水平上調(diào)，從而增強了細胞抗損傷性有關。Yang等[30]也發(fā)現(xiàn)，TLR3多態(tài)性rs3775291的412Phe變異體可以通過抑制RPE細胞的死亡來保護干性ARMD患者視網(wǎng)膜不進展至GA。此外，對TLR在ARMD中的作用主要集中于基因的研究。一項包含6項研究的Meta分析報告了TLR4與ARMD易感性的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性rs4986790(Asp299Gly)與ARMD易感性顯著相關[31]。除此之外，TLR2、TLR3、TLR7等基因多態(tài)性也曾多次被報道與ARMD易感性相關[32-33]，但這種關聯(lián)在印度及東亞等地區(qū)人種上卻沒有發(fā)現(xiàn)，說明可能存在地區(qū)或人種的差異[34-36]。

3炎癥小體

炎癥小體是一類在細胞內(nèi)形成的多聚體蛋白質(zhì)復合物，可介導對病原體感染和組織損傷的免疫反應，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[37-38]。經(jīng)典炎癥小體的結構由PRR等識別分子、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1的前體(pro-caspase-1)等三部分構成并根據(jù)其細胞內(nèi)受體命名，主要包括NOD樣受體家族(NLRs)、AIM2樣受體家族(ALRs)、RIG-Ⅰ樣受體家族(RLRs)及Pyrin蛋白等[39-40]。炎癥小體在體內(nèi)由PAMP或DAMP等激活后，ASC即啟動對caspase-1的激活及對白細胞介素(IL)-1β、IL-18前體的剪切活化，釋放至細胞外參與免疫反應過程[41-42]，這與阿爾茲海默癥、糖尿病等與衰老相關的慢性炎性過程密切相關[43-45]。

自2002年炎癥小體的概念被提出以來，NLRP3是目前為止研究最多、具有最廣泛激活劑的炎癥小體，可通過鉀外流、溶酶體失穩(wěn)及活性氧(ROS)的生成等多種機制激活[46]。2012年，Doyle等[47]發(fā)現(xiàn)ARMD患者的亞RPE玻璃膜疣沉積成分可以激活外周髓細胞和單核細胞中的NLRP3炎癥小體和caspase-1，導致成熟IL-1β和IL-18的分泌，從而提出NLRP3參與ARMD的概念。近年來隨著研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的活化可能是氧化應激、光損害等造成干性ARMD玻璃膜疣、視網(wǎng)膜變性等病理改變的關鍵機制[48]。

淀粉樣β(Aβ)和脂褐素的主要成分N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)均可在玻璃膜疣中檢出，它們通過激活NLRP3炎癥小體誘導的慢性炎癥被認為是早期ARMD的關鍵致病過程[49-51]，Tseng等[52]對具有GA的晚期干性ARMD患者眼組織進行切片染色，結果顯示病變部位NLRP3著染，進一步檢測發(fā)現(xiàn)患者RPE細胞中NLRP3、ASC和pro-caspase-1均高表達。Piippo等[53-54]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于蛋白酶體抑制劑MG-132及巴弗洛霉素A1(BafA)的RPE細胞處于高度氧化應激狀態(tài)，釋放的ROS通過激活NLRP3炎癥小體生成IL-1β，從而觸發(fā)大量IL-8的產(chǎn)生，導致進一步病理性炎癥的發(fā)生，而抗氧化劑的使用阻止了這一過程的發(fā)生。Wooff等[55]對干性ARMD模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，依賴于caspase-1的炎癥小體在光氧化損傷引起的視網(wǎng)膜變性中參與了炎癥的發(fā)生和細胞的死亡，而caspase-1的顯著上調(diào)可能與光感受器細胞死亡水平的升高有關[56]。Kerur等[57]則認為GA的發(fā)生可能與環(huán)GMP-AMP合酶(cGAS)介導、caspase-4(在小鼠中為caspase-11)和caspase-1激活的非典型炎癥小體途徑有關。

4細胞因子

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白或多肽的總稱，用于細胞間信號傳導和相互作用。細胞因子家族包括IL、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子和生長因子等[58-59]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ARMD的發(fā)生進展與細胞因子的生理功能關系密切[60]。

4.1白細胞介素IL-18、IL-17和IL-6等多種IL與干性ARMD患者RPE變性萎縮的關系密切。Ijima等[61]檢測ARMD患者血清中IL-18的含量，發(fā)現(xiàn)干性ARMD患者血清IL-18比對照組(無新生血管或視網(wǎng)膜變性等眼底病變的其他眼病人群)高約48.9%，且在小鼠視網(wǎng)膜下注射IL-18可引起類似干性ARMD表現(xiàn)的視網(wǎng)膜變性。在體內(nèi)，IL-18還可通過炎癥小體的激活釋放，Tarallo等[62]發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶DICER1的缺乏誘導人RPE細胞死亡及變性從而導致GA的發(fā)生可能是通過NLRP3炎癥小體的激活分泌IL-18，從而觸發(fā)髓樣分化因子88(MyD88)信號傳導途徑導致。Litwińska等[63]檢測ARMD患者血清多種炎性因子的含量，發(fā)現(xiàn)在校正了年齡、性別等存在的差異后，干性ARMD患者體內(nèi)IL-6及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)濃度較高，而TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-10、IL-12均處于較低濃度。Cao等[64]研究了干性ARMD患者血漿細胞因子與CFH基因Y402H多態(tài)性的關系，發(fā)現(xiàn)CFH-Y402H多態(tài)性純合子高危CC變異患者的IL-6水平顯著高于其他基因型患者，IL-18水平高于CT變異患者，血液中較高濃度的細胞因子可能會使局部視網(wǎng)膜環(huán)境處于促炎狀態(tài)，這也解釋了為什么CFH基因CC變異患者比TT變異患者具有更高的ARMD進展風險。

IL-17家族中IL-17A與IL-17RC在ARMD患者眼中高表達，可能與ARMD的發(fā)展相關。Ardeljan等[65]檢測了晚期ARMD患者眼組織的IL-17含量，發(fā)現(xiàn)與正常組織比，黃斑部IL-17A表達平均高14～20倍，IL-17RC高47～93倍，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)沉默RNA轉(zhuǎn)染、降低了IL-17RC表達能力后，IL-17A活性降低，并顯著降低了caspase-9和caspase-3的激活，抑制了對RPE的細胞毒性。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17RA的高表達及對下游促炎細胞因子的上調(diào)或許是RPE在氧化應激時發(fā)生變性或死亡的關鍵機制[66]。

4.2趨化因子及其受體多種趨化因子及其受體被證實與干性ARMD RPE萎縮及GA的發(fā)生有關。C-C型趨化因子受體3(CCR3)是CCL5、CCL7、CCL11、CCL24、CCL26的受體，Kuse等[67]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)其與光照導致的感光細胞死亡有關，對CCR3的抑制降低了ROS的水平和由光誘導的caspase-3、caspase-7的活化，減緩了小鼠感光細胞的死亡速率。CX3CR1是趨化因子亞家族CX3C唯一成員CX3CL1的特異性受體，近年來被證實與ARMD的發(fā)病關系密切[68]。Combadière等[69]發(fā)現(xiàn)ARMD患者眼底視網(wǎng)膜變性部位有大量小膠質(zhì)細胞的聚集，且CX3CR1表達陽性，并且在玻璃膜疣中發(fā)現(xiàn)了CX3CR1沉積物，因此推斷CX3CR1陽性小膠質(zhì)細胞的積聚可能與玻璃膜疣形成、光感受器變性有關。而敲除了CX3CR1基因的小鼠視網(wǎng)膜下同樣出現(xiàn)脂質(zhì)膨脹的小膠質(zhì)細胞沉積，被認為是干性ARMD玻璃膜疣現(xiàn)象的起源[70]。此外，CCL2、CCR2、CX3CR1等多種趨化因子或受體的基因多態(tài)性都表現(xiàn)了與干性ARMD的相關性[71-72]。

基于趨化因子與視網(wǎng)膜變性的密切聯(lián)系，趨化因子基因敲除小鼠被廣泛用于制作干性ARMD的實驗模型。CCL2和CX3CR1基因缺陷的小鼠均被發(fā)現(xiàn)眼底出現(xiàn)了玻璃膜疣生成、光感受器萎縮及視網(wǎng)膜變性等干性ARMD的典型表現(xiàn)[73-74]。因此，Tuo等[75]制作了CCL2-/-/ CX3CR1-/-雙基因敲除(DKO)小鼠，通過對眼底組織病理學及蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)DKO小鼠在6周齡時即表現(xiàn)出視網(wǎng)膜變性等干性ARMD癥狀，Ross等[76]進一步檢測其眼免疫蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)DKO小鼠與人類ARMD患者顯示出相似的免疫病理學特征，支持CCL2-/-/ CX3CR1-/-作為人類干性ARMD的合適模型。

5小結

干性ARMD是一種由多因素造成的復雜眼病，病因及發(fā)病機制尚不完全明確，且目前尚無有效療法。盡管其具體發(fā)病原因不明，但炎癥及免疫反應在其發(fā)病機制及疾病進展過程中起到了推動作用，而炎癥反應的完成很大程度依賴于免疫分子的活化與信號轉(zhuǎn)導。因此，深入研究各免疫分子在干性ARMD發(fā)生發(fā)展過程中的具體功能及作用途徑，有助于闡明干性ARMD的機制，為干性ARMD的治療提供新的思路。