燕麥分離蛋白消化特性和消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞分泌膽囊收縮素的影響

傅秋云， 方子韻， 宋洪東， 管 驍,*， 羅可大，孫 注， 余治權(quán)

(1.上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院/國(guó)家糧食產(chǎn)業(yè)(城市糧油保障)技術(shù)創(chuàng)新中心， 上海 200093；2.瀏陽(yáng)河集團(tuán)股份有限公司， 湖南 長(zhǎng)沙 410114；3.內(nèi)蒙古燕谷坊生態(tài)農(nóng)業(yè)科技(集團(tuán))股份有限公司， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 011700)

腸內(nèi)分泌細(xì)胞是一大類存在于胃腸道表面，能夠分泌多種激素的錐體形或圓形細(xì)胞。盡管腸內(nèi)分泌細(xì)胞在整個(gè)消化道腸上皮細(xì)胞中的比例小于1%，但它們分布于整個(gè)消化道的表面，構(gòu)成機(jī)體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官[1]。在腸腔特定內(nèi)容物的刺激下，腸內(nèi)分泌細(xì)胞可選擇性分泌20多種肽類和(或)胺類激素，包括膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、胰高血糖素樣肽- 1(GLP- 1)、葡萄糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)、酪酪肽(PYY)、5-羥色胺(5-HT) 以及胃饑餓素等。CCK是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的胃腸激素，除了具有調(diào)節(jié)胰酶釋放、膽囊收縮的生理功能外，亦被發(fā)現(xiàn)在血壓調(diào)控、機(jī)體免疫、胰島素分泌的調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[2-4]。作為一種典型的胃腸激素，CCK在十二指腸、空腸和回腸中高表達(dá)[5]。腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的CCK可直接從細(xì)胞基底部進(jìn)入皮下結(jié)締組織，通過血液或擴(kuò)散方式影響靶細(xì)胞，從而發(fā)揮各種生理功能。有研究曾認(rèn)為，CCK是由小腸內(nèi)分泌I細(xì)胞分泌，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，CCK亦可由小腸內(nèi)分泌L細(xì)胞、K細(xì)胞等表達(dá)和分泌[6]。

在體外實(shí)驗(yàn)中，STC- 1細(xì)胞已作為一種成熟的腸內(nèi)分泌細(xì)胞模型用以研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)CCK表達(dá)和分泌的影響[7]。已有研究表明，β-伴大豆球蛋白、蛋清胃腸消化物以及肉類和土豆蛋白胨酶解物能刺激STC- 1細(xì)胞分泌CCK[8-10]，但未見燕麥分離蛋白水解物相關(guān)的報(bào)道。

本研究擬以制備的燕麥分離蛋白為研究對(duì)象，探究其經(jīng)過模擬胃腸道消化后的消化特性，在以燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物作為優(yōu)質(zhì)蛋白源的前提下，進(jìn)一步探究其對(duì)腸內(nèi)分泌細(xì)胞STC- 1的合成和分泌CCK的影響，以期為擴(kuò)展燕麥分離蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥購(gòu)于河北省淶水縣金谷糧油食品有限公司，產(chǎn)地為淶水縣。

胃蛋白酶(P- 7000)、胰酶(P- 1750)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)品(PageRulerTMPrestained Protein Leader)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó) Thermo Scientific公司；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈(色譜級(jí))，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸(色譜級(jí))，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。STC- 1細(xì)胞，購(gòu)于上海富衡生物科技有限公司；CCK檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S- CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；MYP11- 2型磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；pH計(jì)，Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；H1850型離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCIENTZ- 10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；KjeltecTM8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS分析儀器有限公司；DKZ型系列電熱恒溫振蕩水槽、電熱鼓風(fēng)干燥箱、BWS- 12G型精密恒溫水槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ChemiDocTMImaging System凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司； L- 8900 型氨基酸分析儀，日立儀器(中國(guó))有限公司；配備SPD- 16型紫外可見雙波長(zhǎng)檢測(cè)器的LC- 16型液相色譜，島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司；2000 SWXL型凝膠過濾柱( 長(zhǎng)度300 mm，直徑7.8 mm)，東曹(上海)生物科技公司;二氧化碳培養(yǎng)箱，購(gòu)于普和希健康醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1燕麥的脫脂預(yù)處理

將新鮮燕麥用磨粉機(jī)磨成粉末，用正己烷以2∶1的質(zhì)量比浸提全脂燕麥粉，以400 r/min攪拌2 h，靜置30 min后，傾去溶劑，通風(fēng)櫥下待溶劑完全揮發(fā)，封好，4 ℃儲(chǔ)藏備用。

1.3.2燕麥分離蛋白的提取

脫脂燕麥用蒸餾水以12∶1的質(zhì)量比完全浸泡于燒杯中，用1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至11，磁力攪拌器作用2 h后離心取上清液。將上清液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至其等電點(diǎn)(pH值為4.3)后離心，將沉淀反復(fù)水洗至中性，加少量蒸餾水復(fù)溶，經(jīng)過冷凍干燥后，即得燕麥分離蛋白，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照GB 5009.5— 2010《微量凱氏定氮法》，用全自動(dòng)凱氏定氮儀，對(duì)脫脂后燕麥粉和燕麥分離蛋白中的總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為5.83。

1.3.4燕麥分離蛋白的體外消化模擬

參考Ribeiro等[11]的方法，并稍加修改，進(jìn)行燕麥分離蛋白的體外消化模擬。將1 g燕麥分離蛋白粉末，0.1 mol/L K2HPO4- KH2PO4磷酸鹽緩沖液，與25 mg新鮮制備的胃蛋白酶一起溫育。在孵育之前，用1 mol/L HCl將緩沖液的pH值調(diào)節(jié)至2，在37 ℃下孵育2 h。孵育結(jié)束，將溶液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8后與50 mg新鮮制備的胰蛋白酶溫育2 h。在每次消化步驟結(jié)束后取樣，通過100 ℃水浴8 min結(jié)束消化。離心取上清液冷凍干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5氮含量分布的測(cè)定

在每次消化步驟結(jié)束后，加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白1 h，離心(5 000 r/min，30 min)，取沉淀。沉淀用蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)兩次，于60 ℃烘箱烘干，采用凱氏定氮法測(cè)定沉淀物的蛋白含量。根據(jù)Santos-Hernández等[12]的方法提取消化后上清液中的游離氨基酸，具體方法為：將凍干的上清液粉末，溶于20 mL水中，加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%的5-磺基水楊酸，4 ℃靜置1 h，離心(6 000 r/min，20 min)，取上清液，冷凍干燥。凍干粉末蛋白含量的測(cè)定方法同1.3.3方法，消化后氮含量分布的計(jì)算方法見式(1)至式(4)。

(1)

(2)

(3)

肽氮含量=可溶性氮含量-氨基態(tài)氮含量。

(4)

式(1)至式(4)中：w(沉淀蛋白)，g/100 g;w(粗蛋白)，g/100 g;w(游離氨基酸蛋白)，g/100 g。

1.3.6十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分析是根據(jù)Santos-Hernández等[13]和Vera等[14]的方法并稍加修改進(jìn)行的。用上樣緩沖液[包含62.5 mmol/L Tris·H3PO4(pH值7.5), 1 mmol/L EDTA, 2 g/L SDS, 10 mmol/L二硫蘇糖醇, 1 mmol/L NaN3, 體積分?jǐn)?shù)為33%的甘油]將未消化的、經(jīng)過胃消化的和胃腸消化的燕麥分離蛋白制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL樣品，沸水浴5 min。濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為5%，電壓為80 V；分離膠體積分?jǐn)?shù)為12%，電壓為120 V。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品包含的相對(duì)分子質(zhì)量為10、15、25、35、45、55、70、100、130、180 kDa。凝膠用考馬斯藍(lán)染色，并用凝膠成像儀拍攝圖像。

1.3.7氨基酸含量的測(cè)定

根據(jù)Wang等[15]的方法分析燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物上清液中的氨基酸組成。首先將50 mg樣品置于20 mL安培瓶中，并在密封前與10 mL的6 mol/L HCl混合。在真空下于110 ℃水解蛋白質(zhì)24 h。冷卻后，打開安培瓶，在60 ℃下真空蒸發(fā)水解產(chǎn)物至干。將干燥的樣品溶于4 mL 0.2 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH值為2.2)中，以達(dá)到50～250 nmol/mL的氨基酸濃度。將溶解的蛋白質(zhì)溶液通過0.2 μm過濾器過濾并加載到全自動(dòng)氨基酸分析儀上。

氨基酸自動(dòng)分析儀的條件設(shè)置：分離柱溫度為57 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm,緩沖溶液流速為0.4 mL/min；反應(yīng)液為茚三酮試劑，反應(yīng)液流量為0.35 mL/min；反應(yīng)單元溫度為135 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.8食物蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

采用氨基酸評(píng)分(amino acid score，AAS)，化學(xué)評(píng)分(chemical score，CS)和必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index，EAAI)對(duì)燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[16-17]。計(jì)算方法見式(5)至式(7)。

(5)

(6)

(7)

式(5)至式(6)中，w(受試蛋白質(zhì)中某種氨基酸)，mg/g，以單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)記；w(FAO/WHO評(píng)分模式下參考蛋白質(zhì)中同種氨基酸)，mg/g，以單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)記；w[參考蛋白質(zhì)(全雞蛋) 中同種氨基酸]，mg/g，以單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)記。式(7)中:aa1，aa2，aa3，…aai分別為實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)中的必需氨基酸比率(A/E)(指某種必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分比);AA1，AA2，AA3，…AAi分別為全雞蛋蛋白質(zhì)中的必需氨基酸比率;n為必需氨基酸個(gè)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中為8。

1.3.9分子質(zhì)量的測(cè)定

根據(jù)Fabrice等[18]的方法進(jìn)行燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分的分子質(zhì)量的測(cè)定，并稍加修改。使用液相色譜測(cè)定樣品的肽分子質(zhì)量分布，所用色譜柱為TSK凝膠過濾柱，其流動(dòng)相乙腈、水、三氟乙酸的體積比為45.0∶55.0∶0.1，以0.5 mL/min的流速遞送，柱溫設(shè)定為30 ℃。將10 μL樣品注入HPLC系統(tǒng)中。選取細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 512 Da)、九肽CSKSSDYQC(1 020 Da)、四肽AHLL(453 Da)和三肽GGG(189 Da)為標(biāo)品。按保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，分子質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線。通過將樣品出峰時(shí)間代入分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線獲得燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分的分子質(zhì)量分布。

1.3.10STC- 1細(xì)胞的培養(yǎng)

STC- 1細(xì)胞在補(bǔ)充有體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)前于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.11STC- 1細(xì)胞活力的測(cè)定

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl]-2H-tetrazoliumbromide，MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測(cè)試和評(píng)估燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞活力的影響。在96孔板處理后的STC- 1細(xì)胞中加入MTT，代謝活躍的細(xì)胞將黃色四唑鹽MTT裂解成紫色的甲瓚晶體。將形成的甲瓚溶解，用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)量吸光度，結(jié)果以對(duì)照組的百分比表示。具體方法以MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測(cè)定試劑盒生產(chǎn)說(shuō)明書為依據(jù)。

1.3.12STC- 1細(xì)胞分泌CCK含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5]，將STC- 1細(xì)胞以1.25×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，將細(xì)胞用Hank’s緩沖液洗滌兩次，以除去培養(yǎng)基，用含有不同濃度燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物的緩沖液在培養(yǎng)箱中孵育60 min。孵育結(jié)束后，根據(jù)云克隆膽囊收縮素測(cè)定試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定STC- 1細(xì)胞內(nèi)外的CCK含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013、GraphPadTMPrism8.0版和SPSS 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥分離蛋白得率和純度分析

由1.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，100 g燕麥粉可提取分離蛋白8.51 g，即燕麥分離蛋白得率為8.51%±0.28%。由1.3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：燕麥粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.9%，則燕麥分離蛋白提取率為61.22%；提取的燕麥分離蛋白的純度為76.67%±0.37%。燕麥種類的不同以及提取方法的差別，會(huì)導(dǎo)致燕麥分離蛋白得率或提取率及純度存在差異，如李玉娥等[19]通過堿提酸沉方法提取燕麥分離蛋白，提取率為75%，高于本實(shí)驗(yàn)中燕麥分離蛋白的提取率。許英一等[20]使用堿提酸沉方法得到的燕麥分離蛋白，純度為64.12%，低于本實(shí)驗(yàn)提取的燕麥分離蛋白純度。

2.2 燕麥分離蛋白體外胃腸消化過程中的特性變化

2.2.1相對(duì)分子質(zhì)量的變化

SDS- PAGE分析可以更加直觀地看出燕麥分離蛋白在體外胃腸消化過程中的分子質(zhì)量變化，結(jié)果見圖1。由圖1可知，未經(jīng)消化的燕麥分離蛋白主要組分的分子質(zhì)量分布在10～70 kDa。35～40 kDa和15～25 kDa的兩組蛋白質(zhì)譜帶很明顯，分別對(duì)應(yīng)12S球蛋白的酸性肽鏈(α-亞基)和堿性肽鏈(β-亞基)[21]。此外，根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]，10～15 kDa的條帶是3S球蛋白，25 kDa附近的條帶對(duì)應(yīng)的是燕麥醇溶蛋白，40 kDa附近是燕麥清蛋白，55～70 kDa對(duì)應(yīng)的是7S球蛋白。經(jīng)過胃消化之后，燕麥分離蛋白大部分被消化成小于10 kDa的肽，但在10～15 kDa有不明顯條帶，說(shuō)明仍有3S球蛋白未被胃蛋白酶消化。經(jīng)過胃和腸消化后，可以明顯看到燕麥分離蛋白被全部消化成小于10 kDa的組分。這一結(jié)果說(shuō)明燕麥分離蛋白具有很好的胃腸可消化性。

1.未消化； 2.胃消化產(chǎn)物； 3.胃腸消化產(chǎn)物； 4.Marker。

2.2.2氮含量分布變化

根據(jù)氮含量分布可以更好地看出燕麥分離蛋白在胃腸消化過程中每一階段的消化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，燕麥分離蛋白經(jīng)胃消化后，不可溶性部分(氮含量)的比例為62.58%，可溶性部分(氮含量)為37.42%?？扇苄圆糠种械牡饕怯坞x氨基酸和肽兩種存在形式，其中游離氨基酸比例7.51%，肽比例為29.91%，說(shuō)明經(jīng)胃消化后可溶性組分中肽是主要成分。燕麥分離蛋白經(jīng)胃和腸消化后，不可溶性部分中氮含量比例下降為9.89%，可溶性部分中氮含量比例升高為90.11%。胃腸消化產(chǎn)物可溶性部分中，游離氨基酸的比例為22.8%，肽的比例為67.31%。這一結(jié)果說(shuō)明燕麥分離蛋白在胃部消化較少，主要消化部位在腸道。Santos-Hernández等[13]報(bào)道了大豆蛋白在體外胃腸消化過程中的氮含量分布，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白經(jīng)胃腸消化后不可溶性部分的比例為12.0%，可溶性部分的比例為91.9%。由此可知，燕麥分離蛋白的消化特性與大豆蛋白相當(dāng)。

可溶性部分中白線以下為游離氨基酸所占比例，白線以上為肽所占比例。

生物可及性被定義為化合物在胃腸道中從其基質(zhì)中釋放出來(lái)并由此可被腸道吸收的部分，通常用在胃腸道消化過程中釋放出的可溶性部分占食品總量的比例來(lái)表示[23]。生物可及性是確定食物營(yíng)養(yǎng)效率的關(guān)鍵概念。經(jīng)過胃腸消化后，燕麥分離蛋白的生物可及性為90.11%，這與Sánchez-Velázquez等[24]的研究一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

2.3 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分的特性研究

2.3.1分子質(zhì)量分布

燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分的分子質(zhì)量分布見表1。由表1可知，燕麥分離蛋白經(jīng)體外胃腸消化后可溶性部分的分子質(zhì)量主要在5 000 Da以下，比例超過95%。小于500 Da部分的比例占據(jù)65.65%，500～1 000 Da部分的比例占據(jù)8.39%，1 000～5 000 Da部分的比例占據(jù)21.13%。蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量是影響其吸收的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，小于1 000 Da的寡肽比蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基更容易被腸道吸收且更具有生物活性[25-26]。燕麥分離蛋白體外胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分中小于1 000 Da部分的比例超過74%，說(shuō)明燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化后可以很好地被人體吸收利用。

表1 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物中可溶性部分的分子質(zhì)量分布

2.3.2營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物可溶性部分的氨基酸組成見表2。燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化后，可溶性部分中Glu含量最高，達(dá)到(172.79±2.84)mg/g。其他含量較高的氨基酸包括Asp、Leu、Arg、Phe、Pro和Val。人體不能合成，必須由外界供給的必需氨基酸如Met、Lys、Leu、Val、Ile、Thr、Phe等的含量均較高，總量占據(jù)38.75%，接近于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的40%；必需氨基酸/非必需氨基酸的比值為0.63，高于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.6[27]。

表2 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物可溶性部分的氨基酸組成及含量

燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物可溶性部分的AAS計(jì)算結(jié)果見表3，其中Phe+Tyr的含量均高于FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)模式，Val、Ile、Leu的含量接近FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)模式，Thr、Met+Cys和Lys的含量略低于FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)模式。結(jié)合燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物的可溶性部分的CS和EAAI(見表4)，可知第一限制性氨基酸為Met+Cys，第二限制性氨基酸為L(zhǎng)ys，第三限制氨基酸為Thr。如果將燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物與富含這4種氨基酸的食物配合食用，可調(diào)整各種必需氨基酸的比例，彌補(bǔ)此產(chǎn)物中這4種氨基酸不足的缺憾，便于人體吸收，也能提高各種食物蛋白質(zhì)的利用率。

表3 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物的必需氨基酸評(píng)分

表4 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物CS和EAAI評(píng)分

利用EAAI評(píng)價(jià)原料蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是:EAAI大于0.90的為優(yōu)質(zhì)蛋白源，在0.80左右的為可用蛋白源，小于0.70的為不適宜蛋白源。燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化后可溶性部分的EAAI值為0.95。由此可見，燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物是氨基酸比例相對(duì)均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白源，能較好地滿足人體需要。

2.4 燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞的影響

2.4.1對(duì)STC- 1細(xì)胞活力的影響

用不同質(zhì)量濃度(1、2、3、4、5、6 mg/mL)的燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì) STC- 1細(xì)胞進(jìn)行處理，對(duì)照組為不經(jīng)燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物處理的正常培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞活力記為100%。處理前后的STC- 1細(xì)胞活力變化情況見圖3。由圖3可知：當(dāng)燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1、2、6 mg/mL時(shí)，消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞活力無(wú)明顯影響；當(dāng)燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物質(zhì)量濃度為3、4、5 mg/mL時(shí)，消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為1～6 mg/mL時(shí)，燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4.2對(duì)STC- 1細(xì)胞合成和分泌CCK的影響

細(xì)胞內(nèi)CCK的含量可反映CCK的合成情況，而細(xì)胞外CCK的含量則可反映CCK的分泌情況。用不同質(zhì)量濃度(3、4、5 mg/mL)的燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì) STC- 1細(xì)胞進(jìn)行1 h孵育后，觀察燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物對(duì)STC- 1細(xì)胞合成和分泌CCK的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4(a)可以看出，STC- 1細(xì)胞內(nèi)CCK的含量有顯著性的增加，且胃腸消化產(chǎn)物以劑量依賴性方式刺激STC- 1細(xì)胞合成CCK，5 mg/mL樣品作用于STC- 1細(xì)胞能達(dá)到最大的合成量68 pmol/L。由圖4(b)可以看出，細(xì)胞外CCK的含量有顯著增加，也呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)消化產(chǎn)物為5 mg/mL時(shí)，CCK的分泌量達(dá)到6 pmol/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物可顯著促進(jìn)STC- 1細(xì)胞合成和分泌CCK。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

在食物的胃腸消化過程中，蛋白質(zhì)被水解成多種肽和游離氨基酸。這些蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物可以通過誘導(dǎo)胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞激素來(lái)發(fā)揮生理活性[30]。腸內(nèi)分泌細(xì)胞因其頂端存在營(yíng)養(yǎng)特異性受體而成為能夠感知管腔內(nèi)容物的特化細(xì)胞。這些細(xì)胞分散在腸道上皮中，產(chǎn)生和釋放各種激素調(diào)節(jié)劑，例如產(chǎn)生CCK的Ⅰ細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)胃腸功能和穩(wěn)態(tài)功能。CCK能抑制胃排空，減少胃酸分泌，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物在其釋放過程中充當(dāng)強(qiáng)誘導(dǎo)劑[31]。目前，燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物對(duì)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌CCK的影響未見相關(guān)報(bào)道。

Santos-Hernández等[13]研究發(fā)現(xiàn)，青豆、草豌豆、大豆和扁豆經(jīng)胃腸消化后，其可溶性部分中小于1 000 Da部分的比例只達(dá)到了60%、40%、50%和45%，而本研究表明，燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化結(jié)束后，其可溶性部分中分子質(zhì)量小于1 000 Da部分的比例超過74%，說(shuō)明燕麥分離蛋白比其他谷物蛋白更容易被腸道吸收。燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化結(jié)束后，其生物可及性達(dá)到了90.11%，遠(yuǎn)高于藜麥(70.8%～77.8%)[32]、牛皮豆(70%左右)[33]和大麥(65%)[34]，說(shuō)明燕麥分離蛋白經(jīng)消化后具有很高的生物可及性及營(yíng)養(yǎng)效率。燕麥分離蛋白經(jīng)胃腸消化結(jié)束后，其可溶性部分中總氨基酸含量接近于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值高于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合CS值和EAAI值，可得燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物是氨基酸比例相對(duì)均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白源，能較好地滿足人體需要。

在燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物是優(yōu)質(zhì)蛋白源的基礎(chǔ)上，將其作為研究對(duì)象，探究其對(duì)腸內(nèi)分泌細(xì)胞STC- 1合成和分泌CCK的影響。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，細(xì)胞內(nèi)外的CCK含量都有顯著增加，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說(shuō)明該產(chǎn)物可以促進(jìn)STC- 1細(xì)胞合成并分泌出CCK，可推測(cè)燕麥分離蛋白的胃腸消化產(chǎn)物具有預(yù)防慢性疾病(肥胖、高血壓、糖尿病等)的潛在應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)燕麥分離蛋白的消化特性和消化產(chǎn)物對(duì)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌膽囊收縮素(CCK)的影響進(jìn)行了探討。燕麥分離蛋白主要消化部位在腸道，胃腸消化結(jié)束時(shí)，釋放的可溶性部分氮含量為90.11%，全部消化物分子質(zhì)量均小于10 kDa，且大部分為小于500 Da的小肽(65.65%)，因此燕麥胃腸消化產(chǎn)物完全可以作為短肽型腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑的優(yōu)質(zhì)且經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)原料。燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物氨基酸種類豐富，其中必需氨基酸總量占據(jù)38.75%。根據(jù)AAS和CS評(píng)分，該產(chǎn)物有4種限制性氨基酸分別為Thr、Met、Cys和Lys；根據(jù)EAAI值，燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物是優(yōu)質(zhì)蛋白源。燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物可顯著促進(jìn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞CCK的合成和分泌，后續(xù)研究將進(jìn)一步確定起主要作用的是混合物中的肽類成分還是游離氨基酸；此外，燕麥分離蛋白消化產(chǎn)物發(fā)揮促CCK分泌活性的分子機(jī)制也需深入研究。本研究旨在為進(jìn)一步研究燕麥分離蛋白胃腸消化產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)功能提供參考。