紅細(xì)胞膜包裹的聚多巴胺載補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚納米粒的制備及其藥代動(dòng)力學(xué)

夏晨潔，陳志鵬，李偉東*

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210023）

納米技術(shù)作為“21 世紀(jì)的決定性技術(shù)”，在藥物研發(fā)、疾病治療和診斷及藥物遞送領(lǐng)域發(fā)展迅猛［1］。納米載體以不同形式與藥物分子通過(guò)物理包埋、化學(xué)鍵合，構(gòu)成納米藥物遞送系統(tǒng)。因其尺寸、形狀、材料等特殊性，可有效改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性能，提高療效［2］。但物理包埋存在藥物穩(wěn)定性差、載藥量低的問(wèn)題，化學(xué)偶聯(lián)雖然可以提高藥物的穩(wěn)定性和載藥量［3］，但合成復(fù)雜以及會(huì)對(duì)斷裂后藥物的藥理作用有一定影響。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、高效的策略提高納米藥物的載藥量和穩(wěn)定性是推動(dòng)其轉(zhuǎn)化的重要方向。

聚多巴胺（polydopamine，PDA）可以在堿性溶液中由多巴胺發(fā)生氧化自聚反應(yīng)得到［4］，具有良好的生物相容性和可降解性。更為重要的是，由于其表面具有大量的兒茶酚基和胺基，從而顯示出較強(qiáng)的吸附能力，具有高載藥潛力，適合作為藥物載體［5］。此外，為了進(jìn)一步提高聚多巴胺載藥納米粒在體內(nèi)的駐留時(shí)間，有必要對(duì)其進(jìn)行修飾。細(xì)胞膜仿生技術(shù)利用仿生載體與機(jī)體實(shí)現(xiàn)完美兼容，在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)、靶向、生物相容性等優(yōu)勢(shì)［6-7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，利用紅細(xì)胞膜修飾納米?？梢杂行右輽C(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬［8-9］，延長(zhǎng)其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。

補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（bavachinin，BVA）是從補(bǔ)骨脂中提取的一種異戊烯基黃酮類化合物，具有抗炎［10］、平喘［11］、抗氧化［12］及抗腫瘤［13］等多種藥理作用，具有較為廣闊的開(kāi)發(fā)前景。其中，抗腫瘤作用是目前的研究熱點(diǎn)，但其口服生物利用度低，無(wú)法在體內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度，制約其臨床應(yīng)用，而傳統(tǒng)的脂質(zhì)體等手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)其高載藥量負(fù)載。為此，本研究利用聚多巴胺的強(qiáng)吸附性，構(gòu)建補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚高載藥量?jī)?chǔ)庫(kù)（polydopamine nanoparticles loaded with BVA，BP），進(jìn)一步利用紅細(xì)胞膜修飾，構(gòu)建紅細(xì)胞膜仿生納米粒（erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles，RBC-BP）（圖1），延長(zhǎng)其在體內(nèi)的駐留時(shí)間，并初步研究了該遞送系統(tǒng)的靜脈注射后的小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為，為利用聚多巴胺納米粒構(gòu)建高載藥量納米藥物提供有益的借鑒。

Figure 1 Schematic illustration of the preparation process of erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles (RBC-BP)RBC: Red blood cell; PDA：Polydopamine；BVA：Bavachinin

1 材 料

1.1 藥品與試劑

補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（純度≥98 %，批號(hào)：110502，南京世洲生物科技有限公司）；濱蒿內(nèi)酯（純度≥99 %，批號(hào)：20180203，南京世洲生物科技有限公司）；鹽酸多巴胺（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；PBS（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇、氨水、乙腈（南京化學(xué)試劑有限公司）均為色譜純；甲酸（德國(guó)Merck公司）。

1.2 儀 器

BS-124S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；1736R 低溫高速離心機(jī)（GENE 有限公司）；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）；脂質(zhì)體擠出儀（美國(guó)Avanti 公司）；100CX 透射電子顯微鏡（日本Jeol 公司）；QF-3800 氮?dú)獯蹈蓛x（廣州科雷納儀器設(shè)備有限公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo 公司）；5500 MS 系統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Absciex 公司）。

1.3 動(dòng) 物

ICR小鼠，雌性，SPF級(jí)，體重18 ～22 g（南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 BVA體外含量測(cè)定方法的建立

采用HPLC 法測(cè)定BVA 含量。色譜條件：色譜柱為Kromasil-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01% 甲酸水（75∶25）；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。BVA 在0.10 ～25.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y= 46900x+ 76.948，r2= 0.9998；進(jìn)樣精密度RSD 為0.78 %（n= 6）；加樣回收率平均值（100.00 ± 0.35）%（n= 6），經(jīng)驗(yàn)證該方法滿足BVA的含量測(cè)定要求。

2.2 BP的制備及處方工藝篩選

參照課題組前期制備工藝［14］，利用溶劑置換法制備BP，稱取一定量的BVA 溶于乙醇20 mL 中得有機(jī)相。隨后在攪拌條件下緩慢加入至含PDA的純水5 mL中，通過(guò)室溫?cái)嚢璺跤?fù)載BVA，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，高速離心10 min，棄去上清液得BP。以吸附率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察PDA 與BVA 的比例、溶液pH、孵育時(shí)間和溫度等因素對(duì)PDA 負(fù)載BVA的影響。

2.3 RBC-BP的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)報(bào)道制備RBC［15］，將制備后的RBC和BP 納米粒進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)混合液的pH，常溫振搖孵育，高速離心，棄上清液，加入PBS 溶液混勻，得RBC-BP 粗懸液，通過(guò)脂質(zhì)體擠出儀進(jìn)行多次擠壓，制備得粒徑均一的RBC-BP 混懸液。為了更好地利用正負(fù)電荷作用實(shí)現(xiàn)包裹，考察pH 對(duì)BP 電位的影響，以PDI 為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察擠出次數(shù)對(duì)RBC-BP粒徑和均一性的影響。

2.4 RBC-BP的表征

2.4.1 外觀形貌觀察 用移液槍分別吸取少量的BP、RBC和RBC-BP，滴加到銅網(wǎng)，用磷鎢酸負(fù)染法染色，自然晾干，將制得的樣品通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。

2.4.2 粒徑與電位測(cè)定 取上述制備所得的RBC、BP 和RBC-BP，用粒度測(cè)定儀測(cè)定不同樣品的粒徑和Zeta電位。

2.4.3 吸附率與載藥量的測(cè)定 稱取固定量的BP 或RBC-BP，加入破膜劑（異丙醇-無(wú)水乙醇，4∶1），充分吹打并渦旋，高速離心10 min，取上清液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，HPLC 進(jìn)樣分析，測(cè)定BVA 的含量，計(jì)算其質(zhì)量。按下述公式計(jì)算吸附率與載藥率：吸附率=（載體中BVA 的量/BVA 的加入量）× 100 %，載藥率=（載體中BVA 的量/制劑的總量）× 100 %。

2.4.4 釋放行為研究 取BVA、BP 和RBC-BP 1 mL置于透析袋內(nèi)，放入pH 7.4的溶出介質(zhì)10 mL中，37 ℃振蕩，在給定時(shí)間點(diǎn)取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定BVA 含量，計(jì)算累積釋放率，繪制時(shí)間-累積釋放率曲線。

2.5 小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 給藥及取樣 ICR 小鼠75 只，隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。分別尾靜脈注射BVA、BP、RBC-BP，給藥劑量為40 mg/kg。分別于給藥后1、4、8、12、24 h，摘眼球取血約0.5 mL，置預(yù)先裝有肝素鈉的試管中，3000 r/min 離心10 min，分離血漿，-20 ℃條件下保存，備用。

2.5.2 血漿樣品處理方法 取小鼠血漿樣品90 μL于1.5 mL EP 管中，加入內(nèi)標(biāo)液10 μL，振搖混合均勻，再加入乙腈290 μL，渦旋5 min，13000 r/min 離心10 min，取上清液300 μL，真空濃縮后，加甲醇150 μL 復(fù)溶，13000 r/min 離心10 min。取上清液用于UHPLC-MS/MS分析。

2.5.3 體內(nèi)分析方法建立 色譜質(zhì)譜條件：流動(dòng)相為0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0.01 ～1.0 min，5% ～75%（B）；1.0 ～3.5 min，75%（B），4.5 ～5.0 min，75% ～50%（B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。離子源為ESI 源；CUR：35 psi（1 psi = 6.895 kPa）；CAD：8 V；IS：5500 N；TEM：600 ℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在血漿中1 ～1250 ng/mL 線性關(guān)系良好，回歸方程為y= 0.00130x+ 0.00756，r2= 0.9999；方法學(xué)考察顯示符合生物樣品的分析控制要求。

3 結(jié)果與討論

3.1 BP的制備及處方工藝篩選

PDA 與BVA 比例、溶液pH、孵育時(shí)間和溫度對(duì)PDA 負(fù)載BVA 的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2-A 所示，當(dāng)固定PDA 用量時(shí)，BVA 在一定范圍內(nèi)均可被負(fù)載，吸附率穩(wěn)定在90% 以上，隨著B(niǎo)VA 加入量的增加，質(zhì)量比例大于1∶0.5 時(shí)，PDA 的吸附逐漸趨于飽和，吸附率呈下降趨勢(shì)。溶液pH 影響研究結(jié)果顯示（如圖2-B 所示），隨著pH 增加，吸附率出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH 為7 時(shí)，吸附率最高。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，吸附率顯著增加，而當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)6 h 后，吸附率趨于穩(wěn)定（如圖2-C 所示）。孵育溫度在10 ～40 ℃時(shí)，對(duì)吸附率沒(méi)有明顯影響。

綜上，最終確定PDA 負(fù)載BVA 的處方和工藝參數(shù)為：PDA 與BVA 的質(zhì)量比例為1∶0.5、溶液pH為7、孵育時(shí)間為6 h、孵育溫度為20 ℃。

Figure 2 Changes in adsorption rate under different ratios of PDA to BVA (A)，pH（B），incubation time（C）and incubation temperature（D）(±s, n = 3)***P ＜0.001

3.2 RBC-BP的構(gòu)建

溶液pH 對(duì)BP 表面電荷影響結(jié)果如圖3-A 所示，隨著pH 的增加，BP 表面電荷逐漸降低，在pH 4 ～7 時(shí)，由正電荷轉(zhuǎn)為負(fù)電荷。依據(jù)細(xì)胞膜外側(cè)正電荷內(nèi)側(cè)負(fù)電荷的特性，巧妙地選擇BP 在負(fù)電荷時(shí)進(jìn)行包覆，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的定向包裹。而當(dāng)pH為2 時(shí)，BP 有聚集變大的趨勢(shì)，故而本研究選擇的溶液pH為4。

擠出次數(shù)對(duì)RBC-BP 的影響如圖3-B 所示，經(jīng)200 nm 的聚碳酸酯膜擠壓，平均粒徑控制在200 ～300 nm，隨著擠出次數(shù)增加，PDI逐漸減小，擠出達(dá)3 次以上時(shí)，PDI 無(wú)明顯變化。通過(guò)反復(fù)擠出可以改善粒徑分布，獲得均一性良好納米粒。

Figure 3 BP Zeta potential of different pH（A）and particle size and PDI of RBC-BP with different extrusion times（B）(±s, n = 3)

3.3 RBC-BP的表征

3.3.1 外觀形態(tài)觀察 BP、RBC 和RBC-BP 的透射電鏡照片見(jiàn)圖4。如圖4-A 和4-B 所示，BP 具有良好的球形形貌，RBC 多以碎片存在，部分自發(fā)聚集形成不規(guī)則的囊泡，圖4-C 所示，RBC-BP 呈明顯的核殼結(jié)構(gòu)，球形的BP 外周包裹了一層膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明細(xì)胞膜成功包覆。

Figure 4 Transmission electron microscopy of RBC（A），BP（B）and RBC-BP（C）

3.3.2 粒徑與電位測(cè)定 BP、RBC 和RBC-BP 粒徑電位結(jié)果見(jiàn)圖5。 BP 的粒徑為（146.67 ±11.90）nm，由于RBC 部分發(fā)生自身聚集形成不規(guī)則囊泡，其粒徑為（213.67 ± 34.63）nm，與BP 相比，制得的RBC-BP 粒徑有所增大為308 nm。RBC-BP 的電位為（4.78 ± 0.76）mV，與RBC 的表面電位（4.89 ± 0.19）mV 相似，間接證明了RBCBP的成功制備。

Figure 5 Particle size and Zeta potential of polydopamine nanoparticles loaded with BVA (BP)，RBC and RBC-BP (±s, n = 3)

3.3.3 載藥量及藥物釋放情況 使用HPLC 法檢測(cè)BP 和RBC-BP 中BVA 的含量，根據(jù)公式計(jì)算包封率和載藥率，測(cè)得BP 吸附率為（92.08 ±0.17）%，載藥率為（42.05 ± 2.95）%；RBC-BP 吸附率 為（92.72 ± 3.31）% ，載 藥 量 為（30.23 ±4.32）%，吸附率無(wú)顯著變化，證明包覆過(guò)程無(wú)藥物滲漏。

BVA、BP 和RBC-BP 的累積釋藥曲線見(jiàn)圖6。BVA 溶液表現(xiàn)出快速釋放的特征，在1 h 內(nèi)已經(jīng)釋放近97% 的藥量；BP 組在前4 h 釋放了約50% 的BVA，之后釋放速率減慢，48 h 累積釋放量為67 %；RBC-BP在前2 h釋放了約20 %的BVA，之后幾乎不釋放，48 h累積釋放量?jī)H為30 %。

綜上，PDA 具有較高的載藥能力，且在生理環(huán)境下較為穩(wěn)定，進(jìn)一步用細(xì)胞膜包裹后，其穩(wěn)定性增加。

Figure 6 Cumulative release curves of BVA,BP and RBC-BP in vitro(±s, n = 3)

3.4 藥代動(dòng)力學(xué)研究

采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)3P97軟件包進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 BVA、BP 和RBCBP 藥時(shí)曲線見(jiàn)圖7，其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。與BVA 溶液劑相比，BP 和RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞分別是BVA 的2.0 倍、2.5 倍和5.4 倍、3.2倍。RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞是BP 的2.6 倍 和1.2 倍，表明紅細(xì)胞膜的包裹能夠進(jìn)一步提高BP的體內(nèi)駐留時(shí)間。

Figure 7 Plasma concentration-time curves of BVA、BP and RBC-BP(±s, n = 5)

Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)

Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)

**P ＜0.01, ***P ＜0.001 vs BP group

Parameter AUC0-t/(mg/L·h)AUC0-∞/(mg/L·h)MRT0-t /h MRT0-∞/h BVA 9.72 ± 4.269.84 ± 4.253.76 ± 0.513.97 ± 0.55 BP 16.74 ± 7.1020.18 ± 10.795.50 ± 0.7810.00 ± 5.37 RBC-RBC 47.29 ± 10.15***53.18 ± 13.85**7.82 ± 0.27***12.51 ± 0.99

4 結(jié)論

近年來(lái)，納米藥物取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是能夠轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床的卻很少，載藥量、穩(wěn)定性以及工業(yè)化的可行性一直是限制其發(fā)展的主要瓶頸。從中藥中提取分離獲得多種生理活性良好的化合物，由于溶解度低等問(wèn)題制約其臨床應(yīng)用。

本研究依據(jù)PDA 的強(qiáng)吸附性，實(shí)現(xiàn)對(duì)BVA 高效負(fù)載，制備BVA 的高載藥量?jī)?chǔ)庫(kù)，為進(jìn)一步制備新型遞釋系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)。其次，利用紅細(xì)胞膜仿生技術(shù)進(jìn)一步修飾載藥納米粒，基于紅細(xì)胞膜內(nèi)負(fù)外正的電荷特性，巧妙通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH 實(shí)現(xiàn)對(duì)PDA 的電荷調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜定向包覆納米粒的目的。成功構(gòu)建具有長(zhǎng)循環(huán)特性和高載藥量的遞送系統(tǒng)，其臨床轉(zhuǎn)化有望在將來(lái)實(shí)現(xiàn)為腫瘤治療。

PDA 作為一種新型載體，載藥方式多樣且可調(diào)控性強(qiáng)，可以負(fù)載多種成分，進(jìn)一步研究其載藥機(jī)制，有望將其作為負(fù)載多成分的載體，在中藥多組分負(fù)載具有良好的應(yīng)用前景，也為中藥制劑的現(xiàn)代化研究提供一種新的方向。同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜包覆時(shí)的條件，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的定向包裹，最大程度地保留其生理學(xué)特點(diǎn)，也為細(xì)胞膜修飾遞釋系統(tǒng)的應(yīng)用提供了有益的借鑒。