化學(xué)-光熱聯(lián)合治療的靶向鉑藥納米微球的構(gòu)建及體外評價

唐 瑾，王 宇，楊 歲，孫 玉，2*

（1皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，蕪湖241002；2皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)用材料合成應(yīng)用研究所，蕪湖241002）

化療因其較高的治療效率被公認為是腫瘤治療的主要手段，但傳統(tǒng)的化療藥物因選擇性差、副作用大，無法滿足臨床需求。靶向納米給藥系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)治療方法的局限性，在給藥靈活性、低毒性和藥物控釋等方面顯示出高于游離藥物的臨床優(yōu)勢。通過在納米粒（NPs）的表面偶聯(lián)抗體、核酸適配體、多肽等靶向因子，納米粒的特異性能得到顯著增強，能實現(xiàn)主動靶向給藥目的，使腫瘤治療進入精準(zhǔn)靶向治療時代［1-3］。單克隆抗體是一個應(yīng)用非常成功的靶向因子，經(jīng)單抗修飾的納米粒能識別細胞表面生物標(biāo)志物并將藥物遞送至靶組織，從而啟動載藥納米粒的受體內(nèi)吞作用，提高藥物治療效果［4-5］。 西妥昔單抗（cetuximab，C225，愛必妥?）是FDA 批準(zhǔn)上市的人/鼠嵌合型抗EGFR 的IgG1 型單克隆抗體，主要用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、局部晚期或復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細胞癌、晚期非小細胞肺癌及其他惡性實體瘤的治療［6］。目前，西妥昔單抗還被用于納米粒表面的修飾，從而實現(xiàn)腫瘤藥物的靶向釋放、克服腫瘤對單克隆抗體的耐藥性、降低藥物的非特異性毒性等［7-8］。

光熱療法（PTT）是一種新型的非侵襲性腫瘤治療方法。其利用光熱劑在腫瘤中聚集的特性，通過激光照射刺激造影劑引起腫瘤細胞熱損傷，進而導(dǎo)致腫瘤細胞變性壞死，具有時空選擇性好、副作用小、侵襲性小等優(yōu)點［9-10］。將光熱療法和化療聯(lián)合使用的化學(xué)-光熱聯(lián)合療法是一種有著廣闊應(yīng)用前景的治療方法［11-13］，該方法中光熱療法以協(xié)同方式增強化療藥物的細胞毒性，共同抑制腫瘤的發(fā)展；該方法能最大限度地減少光熱劑和化學(xué)藥物的使用，從而減少劑量相關(guān)副作用以及熱療引起的組織損傷和炎癥。為實現(xiàn)化學(xué)-光熱聯(lián)合治療，最常采用的策略是將兩種或多種不同的治療藥物與光敏劑包裹在一起制成納米顆粒進行體內(nèi)運輸。吲哚菁綠（ICG）是FDA 批準(zhǔn)用于臨床的近紅外成像試劑，也是光熱療法中常用的造影劑。將ICG 包裹或摻雜進納米粒中，能避免ICG 的自淬滅，提高穩(wěn)定性和循環(huán)時間，促進ICG 在腫瘤中的積聚［14］。而如果這些納米粒負載了化療藥物且又被靶向配體所修飾，則可實現(xiàn)腫瘤特異性靶向，實現(xiàn)化學(xué)-光療聯(lián)合治療［15-17］。

順鉑（cisplatin，CDDP）是1978年被FDA 批準(zhǔn)上市的第1 個鉑類抗腫瘤藥物，廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌等實體瘤的治療［18］。但其水溶性小、不良反應(yīng)大、易產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用范圍和治療效果受到限制［19］。因此，為提高順鉑的治療效果、降低不良反應(yīng)，本研究構(gòu)建了一種能被近紅外光激發(fā)、表面由西妥昔單抗修飾、核內(nèi)載有順鉑和吲哚菁綠的納米微球，并表征其理化性質(zhì)、評價其體外活性。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

順鉑（99%，山東鉑源藥業(yè)有限公司）；西妥昔單抗（5 mg/mL，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；馬來酰亞胺-聚乙二醇3400-聚乳酸34000（Mal-PEG3400-PLA34000）和 甲 氧 基- 聚 乙 二 醇2000- 聚 乳 酸8000（MPEG2000-PLA8000）（上海芃碩生物科技有限公司）；CCK8 試劑盒和DAPI 染色液（碧云天生物技術(shù)研究所）；annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；Nano ZS90 型納米粒度電位儀（英國Malvern Zetasizer 公司）；Ultrospec 7000 型紫外可見分光光度計（美國GE公司）；Optima 8000電感耦合等離子光譜質(zhì)譜儀（美國PE 公司）；SP8 激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；FACSVerse 流式細胞儀（美國BD 公司）；XthermT3 紅外熱成像儀（合肥英睿系統(tǒng)技術(shù)有限公司）。

1.3 細胞株

人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細胞系MCF-7購自中科院上海細胞所。

2 方法

2.1 靶向載藥微球CPINPs的制備

首先制備巰基化西妥昔單抗（Cetuximab-SH）：向西妥昔單抗溶液（100 μL，5 mg/mL）中加入20倍過量的14 mmol/L 2-亞氨基噻吩（Traut′s 試劑）室溫反應(yīng)1 h，加適量EDTA緩沖液（pH 8）透析、離心，用Ellmann′s 試劑測定巰基數(shù)目。然后，參考文獻［20-21］并略作修改后制備靶向載藥微球CPINPs：用二氯甲烷配制1 mg/mL的聚合物溶液（由MPEGPLA 和Mal-PEG-PLA 按質(zhì)量比1∶1 組成），用去離子水配制1 mg/mL 的ICG 溶液和1 mg/mL 的CDDP溶液。取去離子水6 mL，加入ICG 和CDDP溶液各1 mL，混勻，超聲下（20 kHz，285 W）滴加聚合物溶液2 mL，繼續(xù)超聲乳化6 min，然后將乳液室溫避光敞口攪拌24 h。將乳液轉(zhuǎn)入超濾管（3000 MWC，15 mL）中離心（5000 r/min，4 ℃，25 min），除去殘留的有機溶劑和未被包裹的藥物，得未偶聯(lián)單抗的載藥微球PINPs。將超濾后的微球乳液用適量PBS（pH 7.4）稀釋，加上述巰基化處理后的西妥昔單抗溶液30 μL，冰水浴下避光反應(yīng)24 h。之后加入2-巰基乙醇1 μL，繼續(xù)反應(yīng)15 min。再次將乳液超濾20 min，即制得西妥昔單抗修飾的載藥微球CPINPs。

2.2 靶向載藥微球CPINPs的表征

超濾后的微球用磷鎢酸溶液負染，自然晾干，用透射電子顯微鏡（TEM）觀察其表觀形態(tài)。用納米粒度電位儀（DLS）測定25 ℃時微球的粒徑、粒徑分布、Zeta 電位。用紫外-可見分光光度計測定微球中ICG 的含量：取上述CPINPs 溶液100 μL 加入二甲亞砜（DMSO）3 mL超聲，直至其結(jié)構(gòu)被完全破壞為均一溶液，用紫外-可見分光光度計測定779 nm 處的吸收度。用電感耦合等離子光譜質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定微球溶液中的鉑元素含量，核算順鉑含量。包封率（EE）=（包裹的藥物質(zhì)量/最初加入的藥物質(zhì)量）× 100%，載藥量（LE）=（包裹的藥物質(zhì)量/微球的質(zhì)量）× 100%。

2.3 微球表面單抗偶聯(lián)率測定

用BCA 試劑盒測定CPINPs 中西妥昔單抗的偶聯(lián)率［22-23］。按試劑盒說明配制BCA 工作液和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用酶標(biāo)儀測定562 nm 處的吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線。同法配制CPINPs 樣品溶液，測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的單抗含量和偶聯(lián)率。

2.4 光熱效應(yīng)測定

分別將CPINPs 溶液（ICG 質(zhì)量濃度為40 μg/mL）1 mL、游離ICG 溶液（40 μg/mL）、PBS 溶液（pH 7.4）置1.5 mL 離心管中，用近紅外光（808 nm，1.6 W/cm2）照射，用紅外熱成像儀記錄各溶液的溫度-時間變化曲線，評價光熱效應(yīng)。

2.5 細胞培養(yǎng)

選用EGFR 抗原高表達的人非小細胞肺癌細胞株A549 以及EGFR 抗原陰性表達的人乳腺癌細胞株MCF-7 進行細胞實驗［24-25］。A549、MCF-7 細胞均貼壁生長，采用含10% 胎牛血清、1% 雙抗的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 ～4 天傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.6 體外細胞攝取

采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀測靶向載藥微球的細胞內(nèi)在化過程及細胞內(nèi)的分布情況。具體操作如下：將A549 和MCF-7 細胞按每孔5 × 104個細胞的密度接種到共聚焦培養(yǎng)皿（φ= 20 mm）中，用RPMI 16402 mL 孵育24 h。移去培養(yǎng)基，分別加入含有CPINPs 或游離ICG（ICG質(zhì)量濃度均為20 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基1.5 mL，37 ℃繼續(xù)孵育3 h，然后用PBS 沖洗細胞2次，用多聚甲醛溶液（4%）固定細胞20 min。再用DAPI 1 mL 染色細胞核5 min，PBS 沖洗3 次，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞。熒光成像中，DAPI的激發(fā)波長λEX= 405 nm，ICG 的激發(fā)波長λEX=561 nm。為研究光熱效應(yīng)對細胞攝取的影響，當(dāng)細胞加入含有CPINPs 的新鮮培養(yǎng)基后，先用近紅外光（808 nm，1.6 W/cm2）照射3 min，再按上述步驟進行孵育、染色、觀察細胞攝取過程。

2.7 體外細胞毒性及光熱治療效果

采用CCK8 實驗測定靶向載藥納米微球CPINPs 的細胞毒性，以順鉑和游離ICG 為陽性對照，用GraphPad Prism 軟件計算IC50。具體操作如下：將A549 細胞株按每孔5 × 103個細胞的密度接種到96 孔板中，用RPMI 1640100 μL 培養(yǎng)基孵育24 h。移去培養(yǎng)基，將含相等鉑藥濃度的CPINPs和CDDP、等光敏劑濃度的游離ICG 用新鮮培養(yǎng)基等比稀釋后加入各孔，孵育24 h。沒有給藥的細胞作為空白對照組，加樣后先用近紅外光照射處理（808 nm，1.6 W/cm2，1 min）的細胞作為光熱治療組。然后向每孔中加入增強型CCK8溶液10 μL并輕輕混勻，培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm 處的 吸 收 度，細 胞 存 活 率=［（A測試-A空白）/（A對照-A空白）］× 100%。

3 結(jié)果與討論

3.1 CPINPs的制備及表征結(jié)果

采用自組裝超聲乳化法制備了基于西妥昔單抗的靶向載藥微球CPINPs：超聲下MPEG-PLA 和Mal-PEG-PLA 能很快在DCM 溶液中混為均一透明溶液，當(dāng)?shù)渭舆MICG 和順鉑水溶液時，順鉑和ICG被包裹進入微球中，反應(yīng)液逐漸變?yōu)榫?、清澈的墨綠色。后經(jīng)室溫攪拌揮發(fā)除去DCM 后，溶液仍為墨綠色。加入巰基化單抗與之反應(yīng)，部分微球發(fā)生了團聚，但溶液顏色不變。 如圖1 所示，MPEG-PLA 與Mal-PEG-PLA 中的疏水性PLA 鏈 段包裹順鉑和ICG形成內(nèi)核，當(dāng)加入巰基化西妥昔單抗后，馬來酰亞胺基與巰基發(fā)生偶聯(lián)，西妥昔單抗與PEG 鏈段一起形成微球的親水性外殼。PEG 鏈段的引入使得微球具有隱匿性，可延長其體內(nèi)循環(huán)時間［26］；西妥昔單抗的引入既可發(fā)揮與順鉑的聯(lián)合治療，又使微球具有主動靶向性。

Figure 1 Preparation scheme of cetuximab-decorated and near-infrared (NIR)-activated nanoparticles (CPINPs)MPEG-PLA: MPEG2000-PLA8000; Mal-PEG-PLA: Mal-PEG3400-PLA34000; CDDP: cisplatin; ICG: Indocyanine Green

Figure 2 Characterization of CPINPsA: TEM images (bars represent 100 nm); B: Particle size distribution determined by DLS; C: Zeta potential distribution

微球的表觀形態(tài)、粒徑分布和Zeta 電位如圖2所示：TEM 圖顯示微球CPINPs 為規(guī)則的球形，粒徑在100 nm 左右。DLS 測得微球CPINPs 的平均粒徑為（263.9 ± 3.73）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.18 ± 0.03，Zeta 電位為-（23.43 ± 0.42）mV。TEM 所得的粒徑比DLS 所得的粒徑偏小，其原因主要是由于TEM 顯示的是干燥后的微球形態(tài)和粒徑，而DLS 測試的是溶液中微球的水合粒徑，其包含微球表面的PEG水合層，故相對偏大。

采用電感耦合等離子光譜質(zhì)譜儀測定了微球CPINPs 中的鉑元素含量，采用紫外-可見分光光度計測定了微球中的ICG 含量，經(jīng)計算：藥物（以Pt計）包封率為（2.95 ± 0.21）%，載藥率為（0.34 ±0.08）%；ICG 包封率為（61.5 ± 1.41）%，載藥率為（7.70 ± 0.41）%。采用BCA試劑盒測得CPINPs微球表面西妥昔單抗的偶聯(lián)率為（44.0 ± 1.72）%。

3.2 光熱實驗結(jié)果

以PBS緩沖液（pH 7.4）和ICG 溶液為對照，用紅外熱成像儀記錄近紅外光（808 nm，1.6 W/cm2）照射下的CPINPs 微球溶液（相同ICG 濃度）的溫度變化過程，研究微球的光熱效應(yīng)。如圖3 所示，經(jīng)近紅外光照射后，PBS 溶液的溫度幾乎不變，而CPINPs 和ICG 溶液的溫度卻顯著升高。照射4 min 時，PBS 溶液的溫度保留在室溫27 ℃附近，而CPINPs 和ICG 溶液的溫度則超過了43 ℃，此溫度會導(dǎo)致細胞不可逆損傷［27-28］。繼續(xù)NIR照射，CPINPs和ICG溶液溫度進一步上升。照射5 min后，CPINPs 及ICG 溶液的溫度分別達到了46.2 ℃和45.3 ℃，該溫度則會進一步導(dǎo)致腫瘤細胞的巨大損傷。并且，近紅外光照射下CPINPs 的溫度變化幅度明顯大于游離ICG，這與文獻報道［29-30］一致。這可能是由于熱輻射受到微球的截留，使得近紅外照射下的CPINPs具有較高的熱效應(yīng)和較低的散熱，從而導(dǎo)致溫度響應(yīng)幅度增加。

Figure 3 Photothermal effect of PBS, free ICG and CPINPs (NIR: 808 nm, 1.6 W/cm2)A: Time-dependent temperature increase profiles; B: Infrared thermographic images

3.3 細胞攝取實驗結(jié)果

西妥昔單抗能夠通過抗體-抗原的特異性親和作用有效地識別EGFR 抗原高表達的腫瘤細胞，故本研究選擇EGFR 高表達的A549 細胞和低表達的MCF-7細胞作對照實驗，用CLSM檢測微球CPINPs中西妥昔單抗的靶向能力及微球在近紅外光激發(fā)下產(chǎn)生的光熱效應(yīng)。當(dāng)向培養(yǎng)皿里的A549 和MCF-7 細胞中分別加入含相同ICG 濃度的ICG 或CPINPs 溶液孵育3 h 后，用DAPI 對細胞核進行染色，用CLSM 觀測細胞形態(tài)和熒光。如圖4 所示，細胞核被DAPI 染色后呈現(xiàn)藍色熒光，微球因包裹ICG 呈現(xiàn)紅色熒光。研究發(fā)現(xiàn)：游離ICG 作用的A549 和MCF-7 實驗組細胞內(nèi)幾乎沒有紅色熒光，說明游離ICG 溶液難被腫瘤細胞攝取到細胞質(zhì)中。而載藥微球CPINPs 作用的A549 細胞內(nèi)的紅色熒光強度略高于其作用MCF-7 細胞內(nèi)的熒光強度，說明受西妥昔單抗與細胞表面的EGFR 受體的特異性結(jié)合影響，CPINPs 能更多地進入EGFR 受體高表達的A549 細胞內(nèi)。進一步對比研究近紅外光照射對細胞攝取的影響后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CPINPs 經(jīng)NIR 照射激發(fā)后，與其一起孵育的A549細胞內(nèi)的紅色熒光明顯強于無光照處理組，表明NIR 能促使更多的CPINPs 進入到細胞質(zhì)中，使細胞內(nèi)在化效率變高。推測其原因可能與以下兩方面有關(guān)：一是在近紅外光的激發(fā)下，ICG 產(chǎn)生熱效應(yīng)，隨著溫度升高細胞變得活躍，從而增加腫瘤組織對化療藥物的敏感性以及藥物攝取等，直到過熱開始造成細胞損傷［10，30］；二是溫度升高增加了細胞的通透性，從而增強了藥物在腫瘤細胞內(nèi)的積聚［31-32］。由此可見，經(jīng)西妥昔單抗修飾后的微球更易于與EGFR 高表達的腫瘤細胞結(jié)合并被攝取進入細胞內(nèi)，說明其具有主動靶向性，而且近紅外光的照射能有效促進A549 細胞攝取CPINPs 的過程。

Figure 4 Cellular uptake of A549 cells and MCF-7 cells treated with free ICG, CPINPs (with or without NIR laser irradiation) observed by CLSM (Scale bars = 10 μm)

3.4 體外細胞毒性結(jié)果

Figure 5 In vitro cellular viability of A549 cells after 24 h incubation with CDDP, Free ICG and CPINPs (with or without NIR laser irradiation)（±s, n = 3）*P ＜0.05, **P ＜0.01, ***P ＜0.001

以CDDP 和ICG 為陽性對照，采用CCK8 實驗考察靶向納米載藥微球CPINPs 抑制A549 細胞增殖的能力。如圖5 所示，加藥孵育24 h 后，隨著給藥濃度增加，細胞存活率均明顯降低。當(dāng)給藥濃度不是很高時（cPt≤20 μmol/L），CPINPs 的細胞毒性小于游離鉑藥CDDP，推測其原因可能與微球中的鉑藥被包裹在核內(nèi)，需緩慢釋放到核外發(fā)揮作用有關(guān)。但隨著給藥濃度增加，兩者差距逐漸減小。進一步對比研究近紅外光照射對細胞毒性的影響后發(fā)現(xiàn)：近紅外光照射能激發(fā)ICG 產(chǎn)生光熱效應(yīng)，從而增強CPINPs 的細胞毒性，尤其是包裹的ICG 濃度越大，這種熱效應(yīng)更為明顯。當(dāng)給藥濃度cPt≥10 μmol/L 時，受化學(xué)-光熱聯(lián)合作用，NIR 照射的CPINPs 的細胞存活率明顯低于含相同光敏劑濃度的游離ICG 對照組、含相同鉑藥濃度的CDDP 對照組、以及無光照處理的微球組。當(dāng) 給 藥 濃 度 為40 μmol/L 時，NIR 光 照 處 理 的CPINPs 組的細胞存活率僅為（12.50 ± 0.68）%，明顯低于CDDP 組的（17.92 ± 1.51）%、無光照CPINPs 組 的（15.27 ± 1.61）% 、光 照ICG 組 的（42.97 ± 7.89）% 。 進 一 步 計 算 得CDDP 組、CPINPs 組和NIR 光照處理的CPINPs 組的IC50分別為（12.37 ± 0.05）μmol/L、（17.96 ± 0.02）μmol/L、（8.67 ± 0.04）μmol/L。由此可見，微球核內(nèi)包裹ICG 并進行近紅外光照射激發(fā)能顯著提高細胞攝取藥物的過程，提高其抑制腫瘤細胞增殖的能力。因此，近紅外光照射下的CPINPs具有較好的化學(xué)-光熱聯(lián)合作用效果。

4 結(jié)論

靶向給藥是降低抗腫瘤藥物的副作用的有效手段，化學(xué)-光療聯(lián)合治療是提高藥物抗腫瘤活性的重要策略。本研究設(shè)計合成了一種新型的既能靶向EGFR 高表達腫瘤細胞，又具有化學(xué)-光熱療效的抗腫瘤藥物微球CPINPs，并進行了體外評價。該微球是以MPEG-PLA 和Mal-PEG-PLA 為基材成核，核內(nèi)包裹了小分子抗腫瘤藥順鉑以及光敏劑吲哚菁綠，表面經(jīng)西妥昔單抗修飾后而得。TEM顯示微球為規(guī)則的球形，DLS 測得平均粒徑為（263.9 ± 3.73）nm。 在西妥昔單抗的作用下，CPINPs 能主動靶向EGFR 抗原高表達的A549 細胞并被其攝取進入細胞質(zhì)；受808 nm 近紅外光激發(fā)核內(nèi)ICG 后，CPINPs 升溫效應(yīng)明顯，能產(chǎn)生光熱效應(yīng)，并具有化學(xué)-光熱聯(lián)合治療效果；A549 細胞給藥24 h 后IC50為（8.67 ± 0.04）μmol/L，優(yōu)于游離順鉑。本研究可為其他高活性靶向抗腫瘤藥物運輸體系研發(fā)提供新思路。