二甲雙胍的自噬機(jī)制和自噬相關(guān)應(yīng)用前景進(jìn)展

韋少釵，李冠武

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，腫瘤分子生物學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041）

引 言

細(xì)胞自噬是利用溶酶體內(nèi)水解酶降解細(xì)胞質(zhì)中受損成分和細(xì)胞器，使細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種刺激環(huán)境，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種高度保守的自我調(diào)節(jié)機(jī)制.按照底物進(jìn)入溶酶體的方式，細(xì)胞自噬分為3 種途徑，分別為細(xì)胞自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[1].根據(jù)降解底物有無專一選擇性，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬[2].非選擇性自噬對(duì)底物沒有專一性，自噬過程一般先激活mTOR 通路的上游因子，通過Beclin1 復(fù)合體形成隔離膜，接著ATG12 和LC3/p62 系統(tǒng)對(duì)隔離膜的延伸從而形成自噬體，最終與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體對(duì)物質(zhì)進(jìn)行降解.另外一類細(xì)胞自噬可以專一性地降解特定的大分子或細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，這種自噬稱為選擇性自噬[3].

長(zhǎng)期以來人們主要關(guān)注二甲雙胍通過激活A(yù)MPK 能量信號(hào)通路，抑制mTOR 通路[4]，對(duì)自噬起始信號(hào)起調(diào)控作用.但是越來越多研究表明二甲雙胍也能夠?qū)ψ允闪鬟^程進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)參與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的調(diào)節(jié)[5].人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅對(duì)糖尿病的療效顯著，而且它能降低二型糖尿病患者許多惡性腫瘤（如結(jié)直腸癌、前列腺癌等）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6-8]，甚至能延長(zhǎng)二型糖尿病患者的生存時(shí)間[9]，因此二甲雙胍通過調(diào)節(jié)自噬抗腫瘤以及抗衰老的作用引發(fā)人們強(qiáng)烈關(guān)注.但二甲雙胍誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制尚不清楚，本文對(duì)以二甲雙胍誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制及相關(guān)應(yīng)用綜述如下.

1 二甲雙胍對(duì)自噬靶點(diǎn)的影響

1.1 mTOR 通路

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin）分為mTORC1 和mTORC2兩種復(fù)合體，由于它們結(jié)構(gòu)域不同，在細(xì)胞中起不同的作用[10]. mTORC1 主要結(jié)構(gòu)是Raptor、PRAS40，參與自噬、溶酶體合成、脂質(zhì)合成等途徑. mTORC2 是由Rictor、SIN1、Proctor 組成，參與細(xì)胞增殖、代謝和細(xì)胞骨架組成相關(guān)途徑[11].mTORC1 復(fù)合體作為自噬過程的中心樞紐，二甲雙胍主要通過與其相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR 途徑跟LKB1/AMPK/mTOR 途徑參與調(diào)節(jié)自噬過程. 生長(zhǎng)因子能激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，研究表明二甲雙胍在體內(nèi)可以降低胰島素樣生長(zhǎng)因子，減少IGF-1 的合成與分泌[12-13]，使胰島素受體底物不能活化細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），抑制AKT 磷酸化，進(jìn)而抑制mTORC1 磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬或凋亡，最終抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[14-15].其次由于二甲雙胍能抑制線粒體的活性，造成細(xì)胞能量缺乏，激發(fā)LKB1 激酶使AMPK 的Thr172發(fā)生磷酸化.活化的AMPK 激酶不但使mTORC1 上的raptor 的Ser792 位點(diǎn)磷酸化，同時(shí)磷酸化ULK1Ser317 跟Ser777 位點(diǎn)[16-17]，ULK1 與自噬相關(guān)基因（如Atg13、Atg17等）共同參與自噬隔離膜的形成[18]，共同調(diào)節(jié)自噬過程.

1.2 Beclin1 蛋白

Beclin1 可與Vps34、Ambral、Vps15、Atg14 形成PI3K-Beclin1 復(fù)合體參與形成自噬前膜，但是如果Beclin1 與Bcl-2 的BH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，就無法與Vps34 等形成PI3K-Beclin1 復(fù)合體，從而抑制自噬膜生成[19]. 研究者發(fā)現(xiàn)BNIP3 與Bcl-2 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Beclin1，導(dǎo)致Beclin1 與Bcl-2 分開，促進(jìn)形成PI3K-Beclin1 復(fù)合體，誘發(fā)自噬體的形成[20].但是在高糖誘導(dǎo)細(xì)胞受損的情況下，二甲雙胍會(huì)通過激發(fā)Hedgehog 信號(hào)途徑，降低BNIP3 的表達(dá)，增加Beclin1 與Bcl-2 的相互作用，阻滯自噬進(jìn)程[21].然而在H9C2 細(xì)胞中經(jīng)二甲雙胍處理后會(huì)激活細(xì)胞中Jun N 末端激酶1（JUNK1），JUNK1 的激活使Bcl-2Ser70位置發(fā)生磷酸化同時(shí)改變自身BH3 的結(jié)構(gòu)域，使得Beclin1 與BCL2 解離，有利于自噬前體PI3K-Beclin1 復(fù)合物的形成[22-23].

1.3 二甲雙胍與LC3 酯化和P62 連接系統(tǒng)

pro-LC3 蛋白的羧基末端被Atg4 切割，形成LC3Ⅰ狀態(tài)，接著LC3Ⅰ在atg4 和atg7協(xié)作下使LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（PE）形成LC3Ⅱ.LC3Ⅱ與atg5-atg12-atg16 蛋白復(fù)合體以及連接蛋白p62 一起使自噬體膜延伸形成自噬泡，參與受損物質(zhì)的降解.CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ（CEBPD）是一種基本的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，能夠作用于自噬相關(guān)蛋白LC3 的-978/618 和Atg3-1179/-537 位點(diǎn)，促進(jìn)LC3 和Atg3 基因表達(dá)[24]. 二甲雙胍作用于肝癌細(xì)胞（Huh7 細(xì)胞）中，通過降低Src 激酶在酪氨酸416 位點(diǎn)的磷酸化，降低蛋白酶體降解程度，從而增加細(xì)胞中CEBPD 蛋白，使LC3 和Atg3 表達(dá)上升[25]. 研究發(fā)現(xiàn)TRIB3 轉(zhuǎn)錄水平受到SMAD3 基因調(diào)節(jié)，能通過干擾p62 與LC3 的結(jié)合調(diào)節(jié)自噬信號(hào)通路.二甲雙胍治療黑色素瘤細(xì)胞時(shí)會(huì)抑制SMAD3 蛋白磷酸化，同時(shí)干擾賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶5（KAT5）對(duì)SMAD3K333 乙?；?，導(dǎo)致TRIB3 轉(zhuǎn)錄降低，減少其對(duì)p62 與LC3結(jié)合的影響，受損物質(zhì)參與自噬[26].

1.4 二甲雙胍促進(jìn)自噬溶酶體的水解功能

溶酶體中含有50 多余種酸性水解酶，主要功能是接受和降解胞內(nèi)受損的蛋白或細(xì)胞器.溶酶體膜上存在蛋白受體，溶酶體膜內(nèi)的蛋白1 和2、v 型ATP 酶等具有維持結(jié)構(gòu)完整與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ躘27].研究表明在二甲雙胍作用下，可以通過轉(zhuǎn)移折疊蛋白AXIN 和ULK1 共同聚集在溶酶體膜v-ATPase 受體上，從而形成v-ATPase-Ragulator-AXIN/ULK1復(fù)合體，促進(jìn)溶酶體與自噬小體融合成自噬溶酶體[28-29].TAK1 是絲裂原活化蛋白激酶（MAP3K）的成員之一，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可以調(diào)節(jié)蛋白水解酶、黏附分子等的表達(dá)[30].二甲雙胍造成溶酶體損傷時(shí)，會(huì)使溶酶體囊泡中存在的Gal9（半凝集素9）代替膜上USP9X 和TAK1 復(fù)合體，接著使TAK1 在K63 泛素化，增強(qiáng)AMPK/ULK1 誘導(dǎo)自噬[31].近年來，人們發(fā)現(xiàn)TFEB 是調(diào)控溶酶體生成和細(xì)胞自噬的開關(guān)，正向調(diào)控溶酶體酸性水解酶跟膜蛋白的表達(dá)[32]. 研究表明二甲雙胍作用于小鼠體內(nèi)激活自噬標(biāo)志Beclin1、LC3Ⅱ的表達(dá)，降低p62；同時(shí)增強(qiáng)TFEB 在胞質(zhì)中和核中含量，從而提高組織蛋白酶的活性，提高溶酶體中酶的水解能力[33].

2 二甲雙胍對(duì)細(xì)胞器的影響

2.1 線粒體自噬

由于受損線粒體上存在許多線粒體自噬效應(yīng)分子，機(jī)體能產(chǎn)生專一的自噬機(jī)制清除受損的線粒體以維持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)，稱為線粒體自噬.如今人們了解線粒體自噬效應(yīng)分子主要由PINK1/Parkin 蛋白、Nix/BNIP3L 蛋白、MFN 蛋白和FUNDC1 蛋白組成[34].通過體內(nèi)體外研究，二甲雙胍抑制線粒體呼吸鏈上ComplexⅠ的活性，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中NADH 形成NAD+受阻，天冬氨酸的水平下降，造成線粒體功能損傷，從而通過自噬途徑清除受損線粒體[35].二甲雙胍處理人外周血單核細(xì)胞，在電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)大量的線粒體自噬溶酶體，主要其能明顯降低線粒體活性氧，使線粒體中的DNA 受損，促進(jìn)線粒體膜上的PINK1、Parkin、Nix、MFN2 等蛋白表達(dá)，細(xì)胞能清除受損的線粒體，而且改善細(xì)胞功能[36].糖尿病的發(fā)病機(jī)理通常伴隨著線粒體自噬受損和NLRP3 炎癥小體的激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡[37].研究表明在糖尿病心肌細(xì)胞中二甲雙胍可以增強(qiáng)線粒體自噬，從而快速改變線粒體的形狀和功能，通過抑制NLRP3 信號(hào)通路降低caspase1、IL-1 的表達(dá)，減少細(xì)胞壞死[38].

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬指在多種應(yīng)激刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊的蛋白聚集或缺少膽固醇時(shí)，細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激清除物質(zhì)以維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定所激發(fā)的選擇性自噬.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的相互作用可以通過未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的三種主要蛋白，即蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），跨膜激酶1α（IRE1α）以及激活轉(zhuǎn)錄因子6α（ATF6α）調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[39].研究表明，二甲雙胍引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量缺乏，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感應(yīng)器PERK，真核起始因子2α（Eif2α）被PERK 磷酸化，減少蛋白質(zhì)合成，同時(shí)使LC3Ⅱ跟Atg5-Atg12 復(fù)合體上升，通過促進(jìn)自噬增加受損蛋白降解[40].另有研究表明二甲雙胍誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在磷酸化Eif 2α 時(shí)也會(huì)激活A(yù)TF4，ATF4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控ATG12，介導(dǎo)CHOP 活化ATG5，促進(jìn)自噬隔離膜的延伸[41-42]. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬存在六種自噬蛋白受體如（FAM134B、RTN3L、SEC62、CCPG1、ATL3、TEX264），但是關(guān)于二甲雙胍所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬至今鮮有報(bào)道[43].

3 二甲雙胍自噬機(jī)制對(duì)細(xì)胞的影響

3.1 抑制腫瘤增殖生長(zhǎng)

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，二甲雙胍在誘導(dǎo)自噬后能通過阻滯細(xì)胞周期跟促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖.二甲雙胍能使不同腫瘤細(xì)胞停滯在G0/G1 期、G2/M 期，抑制其增殖.在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞（8226 和U266）和黑色素瘤中，二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK/mTOR 自噬途徑，間接促進(jìn)p53 的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子（p21 和p27）表達(dá)上升，于是減少細(xì)胞周期蛋白CyclinD 含量，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因（RB 基因）無法被CyclinD 磷酸化，同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子（E2F）不從RB 上能釋放參與促進(jìn)S 期蛋白的合成[44]，造成細(xì)胞阻滯在G0/G1 期[45-46].在肝癌細(xì)胞中二甲雙胍提高轉(zhuǎn)錄因子CEBPD 的表達(dá)，可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤抑制基因miR-193b-3p 的表達(dá)，從而抑制原癌基因Cyclin D1 跟ETS1 表達(dá)[47]，造成細(xì)胞滯留在G1 期[25]. 二甲雙胍能抑制Akt 的磷酸化，抑制mTOR 的活性，促發(fā)caspase 凋亡，增加caspase3 的切割，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[48].在肺癌細(xì)胞中，二甲雙胍介導(dǎo)自噬促進(jìn)LC3Ⅱ的上升同時(shí)使p62 下降，造成細(xì)胞發(fā)生腫瘤壞死因子（TRAIL）介導(dǎo)的凋亡[49].

3.2 抑制腫瘤侵襲遷移

惡性腫瘤容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，造成多種器官功能性損傷.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）將丟失緊密連接和黏附連接的有極性的上皮樣細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成有遷移能力的間質(zhì)形態(tài)和特征細(xì)胞的過程，大量研究表明二甲雙胍能通過抑制EMT 抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15，50-52].二甲雙胍治療可以直接干擾PP2A 催化亞單位A4 和MID1 的關(guān)聯(lián)，從而釋放PP2A 的催化活性，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞侵襲[53]. YAP 是一種有效的致癌基因，它的異常調(diào)控會(huì)引起腫瘤發(fā)生，二甲雙胍通過上調(diào)miR-381 表達(dá)，下降YAP 蛋白的表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移[54].此外，人們還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬后下降腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子（MTA1），這是另一個(gè)二甲雙胍抑制腫瘤侵襲遷移的途徑[55].

3.3 延緩細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老會(huì)不斷積累損傷的蛋白跟細(xì)胞器，自噬可以分解細(xì)胞內(nèi)受損物質(zhì)，二甲雙胍能通過氧化應(yīng)激和AMPK 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)自噬，延緩衰老，緩解老年相關(guān)疾病[56].二甲雙胍作為自噬激活劑治療衰老的人牙周膜干細(xì)胞，它能減少衰老產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，降低衰老基因（p21、p16）的表達(dá)，同時(shí)激活自噬因子Beclin1、LC3Ⅱ，采用自噬抑制劑（3-MA）加快細(xì)胞衰老進(jìn)程[57].衰老紊亂細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)，二甲雙胍能通過調(diào)節(jié)能量感受器AMPK 的活性，改善細(xì)胞的衰老情況.小鼠在年老時(shí)容易造成神經(jīng)損傷，二甲雙胍能夠通過激發(fā)AMPK/ULK1 依賴的自噬途徑，提高海馬突觸密度，微管結(jié)合蛋白2（MAP2）和突觸后密度蛋白95（PSD95）的含量，減少由七氟醚在老年小鼠中造成的神經(jīng)損傷[58]. 二甲雙胍在心肌細(xì)胞中能夠激活細(xì)胞質(zhì)中AMPKα/mTOR/TFEB 和細(xì)胞核中AMPK/βSkp2/CARM1/TFEB 的通路促進(jìn)自噬[59].老年小鼠容易出現(xiàn)I/R 損傷性心肌細(xì)胞壞死，研究顯示二甲雙胍通過促進(jìn)自噬可以降低壞死激活因子（p-RIP3 跟p-MLKL），同時(shí)干擾p62/RIP1/RIP3 復(fù)合體形成，使p62 能與LC3Ⅱ等自噬蛋白結(jié)合，恢復(fù)老年化受損的心肌細(xì)胞[60].

4 結(jié)語

二甲雙胍作為T2DM 的首選藥，不僅具有良好的降糖作用，而且能誘導(dǎo)多條信號(hào)通路參與對(duì)抗多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤，其中二甲雙胍誘導(dǎo)自噬通路起重要作用. 二甲雙胍在誘導(dǎo)自噬時(shí)能對(duì)不同細(xì)胞的不同時(shí)期產(chǎn)生不一樣的靶點(diǎn)控制，這可以利用二甲雙胍設(shè)計(jì)靶向藥物參與自噬的調(diào)節(jié). 二甲雙胍在多種刺激下能誘發(fā)選擇性自噬（線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬）的產(chǎn)生，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖、侵襲遷移，同時(shí)還具有延緩細(xì)胞衰老等作用，因此仍需不斷研究二甲雙胍誘導(dǎo)自噬機(jī)制，進(jìn)一步為治療腫瘤提供更有效的思路和途徑.