延遲采收對豫中烤煙上部葉生理指標(biāo)和代謝組學(xué)的影響

彭翠云 汪海燕 史宏志 郭 慧 楊惠娟,*

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院核農(nóng)所，浙江 杭州 310000)

煙草(Nicotiana)，在我國種植歷史悠久，隨著經(jīng)濟不斷發(fā)展，我國煙草需求量急劇增加?？緹熒喜咳~是卷煙配方中的重要組成部分[1-2]，我國上部煙葉在工業(yè)使用過程中普遍存在內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)、組織結(jié)構(gòu)緊湊、顏色偏深、煙堿量過高、糖堿比過低等情況，限制了上部葉的使用率[3]。為解決“豫濃香”高端原料供應(yīng)不足的問題，提高豫中煙區(qū)上部葉采收質(zhì)量十分必要。研究表明，在煙葉采收方法上，煙株上部葉片充分成熟后一次性采收可以提高煙葉成熟度[4-5]。此外，在一次性采收的基礎(chǔ)上推遲采收時間也可以提高煙葉成熟度，改善煙葉理化特性及協(xié)調(diào)性[6-7]。田阿林等[8]從安仁煙區(qū)上部煙葉的外觀質(zhì)量和主要化學(xué)成分指標(biāo)兩個方面考慮，分析得出推遲采收可使上部葉質(zhì)量達到最佳；張冰濯等[9]研究發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)上六片煙葉在常規(guī)采收基礎(chǔ)上延遲7 d，可以提高煙葉成熟度。

煙葉在成熟過程中生理生化特性變化復(fù)雜多樣，其中碳氮代謝是煙葉成熟過程中最基本的生理代謝過程[10]。潘飛龍等[11]發(fā)現(xiàn)碳代謝中淀粉及還原糖含量隨著煙葉成熟度增加逐漸上升，直至煙葉工藝成熟期，隨后含量開始下降。抗氧化酶活性是反映煙葉衰老程度的重要指標(biāo)，孫光偉等[12]發(fā)現(xiàn)在煙葉采收過程中，延緩采收上部葉會造成上部葉中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶活性降低，加劇葉片氧化衰老。董洪旭等[13]研究發(fā)現(xiàn)過熟采收的煙葉脯氨酸(proline，Pro)比例較高，欠熟采收的煙葉Pro比例較低；張光利等[14]發(fā)現(xiàn)煙葉在未熟至過熟的過程中，Pro含量呈倒“V”形曲線變化，Pro含量可作為判斷煙葉田間成熟度的生化指標(biāo)。

煙葉中化學(xué)成分含量與烤后煙煙葉的外觀質(zhì)量、致香成分質(zhì)量、評吸質(zhì)量等密切相關(guān)[15]，代謝產(chǎn)物是煙草化學(xué)成分表達的終產(chǎn)物。代謝組學(xué)不僅可以了解煙葉代謝產(chǎn)物的時空積累模式，還可以研究其成分和含量在不同外界環(huán)境條件下的變化情況，其種類和數(shù)量變化是生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng)[16-17]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)在煙草上的應(yīng)用大多集中于土壤、海拔、日照、降雨等生長環(huán)境因素對代謝的影響[18]。2011年Li等[19]創(chuàng)立了一種基于液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS)技術(shù)針對煙葉代謝譜分析的方法，應(yīng)用此方法對津巴布韋和中國兩地?zé)熑~中的代謝物進行了比較,并分析出兩地區(qū)之間主要的差異代謝物。

本研究通過延遲上部葉采收時間，分析推遲不同天數(shù)采收時上部葉中相關(guān)酶活性以及代謝組學(xué)的變化，并研究延遲采收對煙葉質(zhì)量的影響，進一步確定煙葉的適宜采收時間，以期為科學(xué)指導(dǎo)田間采收提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試烤煙品種為中煙100，該品種是許昌烤煙煙區(qū)的主栽品種。試驗于2018年在河南省許昌市襄城縣王洛鎮(zhèn)科技試驗基地開展，該地位于113°03′～114°19′E，33°42′～34°24′N，屬北暖溫帶季風(fēng)氣候區(qū)，熱量資源豐富，雨量充沛，陽光充足，無霜期長，年平均氣溫在14.3℃～14.6℃之間，最熱月在7月，平均氣溫為27.2℃～27.4℃。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選擇地勢平坦，排水條件良好的地塊，行株距為1.20 m×0.55 m，于2018年4月27日移栽，6月30日打頂，每株留葉數(shù)為18～22片，按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)方式，統(tǒng)一進行施肥和中耕管理。

試驗設(shè)置5個處理，每處理3次重復(fù)，小區(qū)面積333 m2。從當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)采收時間9月1日開始，每隔4 d采收一次，采集樣品為每個處理的上部葉，共取樣5次，分別為：9月1日常規(guī)采收(CK)、延遲4 d采收(T1)、延遲8 d采收(T2)、延遲12 d采收(T3)、延遲16 d采收(T4)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 烤煙葉片基本化學(xué)、生理指標(biāo)測定 選取鮮煙葉中間部分注意避開主脈和支脈(面積約為2 cm×3 cm)， 取樣設(shè)置3次重復(fù)。將取得樣品迅速清洗干凈后放入液氮速凍，隨后放入-80℃超低溫冰箱中保存。SOD活性測定采用氮蘭四唑(NBT)光還原法[20]測定；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚還原法[21]測定；CAT活性測定采用紫外分光吸收法[22]測定；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥比色法[23]測定。Pro含量測定先用磺基水楊酸提取，然后在加熱處理下與酸性茚三酮溶液反應(yīng)，再經(jīng)甲苯萃取后，采用酶標(biāo)儀在520 nm波長處測定吸光度值，用以計算Pro含量[24]；還原糖含量、硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthelase，GS)活性測定采用微量試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測定。

1.3.2 代謝組學(xué)測定及分析 采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight liquid chromatograph mass spectrometer，UPLC-Q-TOFLC-MS)對煙草不同處理模式5組樣品進行代謝物鑒定，每組樣品5個時間點，分別為常規(guī)采收(CK)、延遲4 d、延遲8 d、延遲12 d、延遲16 d。通過UPLC-Q-TOFLC-MS技術(shù)獲取指紋圖譜后，采用Analyst TF 1.7 Software導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，通過Peak View去掉異常峰；通過Mark View進行峰對齊。最終獲得包含質(zhì)荷比、保留時間和峰面積的三維數(shù)據(jù)表，利用QC樣品對所有峰進行校正，將校正后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SimcaP v13.0和EZinfo 3.0進行多維統(tǒng)計分析，以便篩選出變量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計，采用SPSS 25.0對統(tǒng)計的數(shù)據(jù)采用T檢驗進行顯著性分析，之后運用GraphPad Prism 8、Origin 2019等軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 延遲采收對抗氧化酶活性及MDA含量的影響

由圖1可知，隨著采收期的延遲及煙葉成熟的增加，煙葉中SOD活性均有不同程度的降低，其中延遲采收4、8、12、16 d(T1、T2、T3、T4)分別較常規(guī)采收期(CK)降低13.46%、19.03%、56.48%、57.45%；POD和CAT活性隨著采收延遲的變化與SOD一致，均呈逐漸下降趨勢，其中延遲16 d采收處理的POD活性最低，與CK相比顯著降低72.56%。MDA含量是反映細胞組織衰老程度的重要指標(biāo)，隨著采收期的延遲，MDA含量逐漸升高，延遲采收16 d時含量達到最高，較CK顯著升高373.68%。隨著采收期的延遲，Pro含量逐漸增加，與CK相比，延遲采收4、8、12 d烤煙葉片的Pro含量分別升高了105.21%、159.91%、255.52%，延遲采收16 d的Pro含量達到最高，說明此時植物抗逆性減弱，葉片成熟度增加。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖1 上部葉延遲采收期過程中抗氧化酶活性及MDA含量的變化趨勢Fig.1 Change trend of antioxidant enzyme activities and MDA content in upper leaves during delayed harvest period

2.2 延遲采收對還原糖含量的影響

由圖2可知，上部葉中還原糖含量隨采收期推遲呈先上升后下降的趨勢，延遲8 d采收時還原糖含量達到最高，較CK提高97.10%；延遲4 d采收時煙葉中還原糖含量較CK呈顯著上升趨勢，較CK提高12.42%；延遲12 d采收時煙葉中還原糖含量開始下降；延遲16 d采收時煙葉中還原糖含量最低，較延遲8 d采收顯著降低63.12%。

圖2 上部葉延遲采收期過程中可還原糖含量的變化趨勢Fig.2 Change trend of reducing sugar contentin the upper flue-cured tobacco leaves during delayed harvest period

2.3 延遲采收對上部葉氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

延遲采收的情況下，煙葉中NR和GS活性變化趨勢如圖3所示。隨著采收期推遲，NR和GS活性逐漸減弱，延遲4、8、12、16 d采收的烤煙NR活性分別較CK顯著降低33.12%、53.74%、73.47%、74.01%。GS活性變化趨勢與NR相似，延遲16 d采收時酶活性達到最低，較CK顯著降低65.62%，延遲4、8和12 d采收時酶活性分別較CK顯著降低22.45%、50.79%、59.72%。

圖3 上部葉延遲采收過程中氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化趨勢Fig.3 Changes in activities of key enzymes in nitrogen metabolism during delayed harvesting of the upper flue-cured tobacco leaves

2.4 延遲采收下上部葉代謝組學(xué)分析

2.4.1 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與評估 為了消除檢測儀器穩(wěn)定度與靈敏度、個體差異性以及噪聲等因素對分析結(jié)果造成的影響，采用Pareto-scaling法對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進行歸一化處理，將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分為正負(fù)離子模式進行分析歸一化后，數(shù)據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，正負(fù)離子模式下的數(shù)據(jù)具有可比性，且經(jīng)過歸一化分析可將不同數(shù)量級的變量轉(zhuǎn)換至合適范圍。經(jīng)過主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)，發(fā)現(xiàn)正模式下數(shù)據(jù)分組分離趨勢明顯，負(fù)模式下分組不明顯，正模式下的代謝物有進一步分析的意義。

2.4.2 不同采收期的下煙葉中代謝物STEM時間序列分析 用Cluster軟件對各采收時間處理上部葉中的差異代謝物進行時間序列分析(short time-series expression miner, STEM)分析，對5個處理的代謝物進行分類，結(jié)果如圖4所示。CK經(jīng)過STEM分析得到兩組顯著類型(P<0.01)，其中一組呈先下調(diào)再上調(diào)趨勢，共35種代謝物；另一組呈持續(xù)下調(diào)模式，共35種代謝物。延遲4 d采收處理經(jīng)過STEM分析得到兩組顯著類型(P<0.01)，其中一組持續(xù)下調(diào)，另一組先下調(diào)再上調(diào)；延遲8 d采收處理經(jīng)過STEM分析得到一組顯著類型(P<0.01)，表現(xiàn)為持續(xù)下調(diào)，代謝物表達趨勢圖顯示共有41種代謝物；延遲12 d采收處理經(jīng)過STEM分析只得到一組持續(xù)下調(diào)的顯著類型(P<0.01)，共有38種代謝物；延遲16 d采收處理經(jīng)過STEM分析得到兩組顯著類型(P<0.01)，一組持續(xù)下調(diào)，一組為先下調(diào)再上調(diào)，代謝物表達趨勢顯示持續(xù)下調(diào)的一組共有34種代謝物，先下調(diào)再上調(diào)的一組共有32種代謝物。

圖4 不同采收期的上部葉代謝物STEM分析Fig.4 STEM analysis of metabolites in lower and upper leaves at different harvesting stages

2.4.3 不同采收期的代謝途徑(kyoto encyclopedia of gens and genomes, KEGG)富集分析 延遲采收情況下，上部葉中差異代謝物共富集在296條代謝通路上，其中顯著富集(P<0.05)的代謝通路共有69條，其中CK的上部葉中顯著代謝通路有11條，延遲4、8、12、16 d采收時上部葉中顯著富集的代謝通路分別有20、13、10和15條。不同采收期下差異代謝物KEGG富集分析結(jié)果如表1所示。

由表1可知，不同采收期中相同的代謝物主要富集在托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成、莽草酸途徑、不飽和脂肪酸的生物合成、萜類化合物和類固醇的生物合成等8條代謝通路中。其中托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代謝4條代謝通路在延遲采收過程中始終呈下調(diào)表達。富集在莽草酸途徑、植物激素的生物合成、萜類化合物和類固醇的生物合成、淀粉和蔗糖代謝4條代謝通路上的代謝物在延遲8 d后呈下調(diào)表達，在延遲8 d之內(nèi)時呈先下調(diào)再上調(diào)的表達。

3 討論

通過對不同采收期處理下的上部位煙葉生理指標(biāo)和代謝組學(xué)變化的分析發(fā)現(xiàn)，隨著采收期的延遲，萜類化合物和類固醇的生物合成途徑、苯丙素生物合成(莽草酸途徑)中的差異代謝物富集表達量呈顯著下調(diào)，其中萜類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中最多的一類，萜類化合物在植物應(yīng)對逆境脅迫中發(fā)揮防御功能，萜類化合物合成途徑中代謝物表達量下調(diào)說明隨著采收期延遲，煙葉內(nèi)部抗逆性機制代謝減弱，因此造成煙葉抗氧化系統(tǒng)中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性下降，抗氧化酶活性下降會造成細胞中活性氧數(shù)量以及MDA含量上升，導(dǎo)致細胞膜過氧化程度增加，細胞組織衰老程度加劇，這與何聰蓮等[25]的研究結(jié)果一致，同時與前人在小麥[26]、甜瓜[27]等作物中的研究結(jié)果相似。苯丙素生物合成中的阿魏酰-5-羥基化酶、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶是木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶[28-29]，而木質(zhì)素在植物抵御外界脅迫過程具有重要作用，能夠提高葉內(nèi)水分遷移有效效率，協(xié)調(diào)煙葉內(nèi)水分散失[30]。苯丙素生物合成生物合成途徑中的阿魏酰-5-羥基化酶、咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶等代謝物表達持續(xù)下調(diào)說明，隨著采收期的延遲煙葉內(nèi)木質(zhì)素含量持續(xù)下降，導(dǎo)致葉片保水能力下降、細胞失水，為維持細胞滲透壓平衡減少細胞失水，煙葉內(nèi)Pro含量上升。

糖類物質(zhì)含量對煙葉的感觀質(zhì)量、煙絲的質(zhì)量及評吸時的香氣和吃味有很大影響。糖類物質(zhì)的積累是植物光合作用與呼吸作用相互作用的結(jié)果，淀粉和蔗糖是烤煙的主要內(nèi)含物質(zhì)，烤煙成熟期煙葉內(nèi)淀粉快速合成、積累，代謝旺盛[31]。張樹堂等[32]研究了不同采收成熟度對烤煙可溶性糖及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著采收時間的推遲和成熟度的提高，還原糖含量逐漸增加，達到某一高點后會降低。羅榮標(biāo)[33]研究上部煙葉田間適宜采收成熟度生理指標(biāo)研究時發(fā)現(xiàn)，延遲采收期會導(dǎo)致上部煙葉中糖類含量上升。本試驗中延遲8 d采收時，煙葉中還原糖含量達到最高，繼續(xù)延遲采收時間葉片內(nèi)還原糖含量開始降低，這表明在延遲采收時間較短情況下植株成熟度增加，導(dǎo)致呼吸作用小于光合作用，糖類物質(zhì)得到積累，而在延遲時間較長的情況下，還原糖含量下降導(dǎo)致植株內(nèi)代謝功能下降。牛德新等[34]研究表明，隨著煙葉的成熟，煙葉內(nèi)淀粉含量呈上升趨勢。楊勝男等[35]研究發(fā)現(xiàn)煙葉成熟期淀粉含量逐漸上升,至煙葉生理成熟期達到最高，隨后淀粉含量下降。本研究中隨著采收期延遲富集在淀粉和蔗糖途徑中的代謝物表達量呈先下調(diào)再上調(diào)表達，延遲8 d采收時上部葉中富集在淀粉和蔗糖代謝途徑中的代謝物開始呈下調(diào)表達，說明采收期推延8 d，煙葉內(nèi)部淀粉合成和積累量達到最高，延遲超過8 d后代謝減慢，煙葉逐漸衰老，糖類物質(zhì)作為能量被消耗，從而含量下降。

煙葉生長發(fā)育過程中各類化學(xué)成分的形成離不開氮代謝，氮代謝對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的形成與提高有重大影響。D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝是植物氮代謝中的關(guān)鍵代謝途徑，隨著采收期的延長，富集在此途徑的谷氨酸脫氫酶等差異代謝物呈下調(diào)變化，已有研究表明谷氨酸脫氫酶在氮、磷脅迫下表達量不同[36]，也有研究結(jié)果表明在逆境脅迫下該酶主要在碳氮代謝中發(fā)揮重要調(diào)控功能[37]，本研究通過分析延遲采收條件下煙葉中的代謝物發(fā)現(xiàn)，隨著采收期延長富集在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝途徑中的主要代謝物表達量下調(diào)，通過測定氮代謝關(guān)鍵酶活性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，NR和GS活性隨著采收期的延長逐漸降低，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝等氮代謝途徑中關(guān)鍵代謝物表達量的下調(diào)說明氮代謝隨著采收期延長逐漸減弱，這也是造成谷氨酸脫氫酶、NR和GS等氮代謝過程中關(guān)鍵酶活性降低的內(nèi)在因素。這與王寒等[38]提出隨著推遲采收時間的延長，頂葉葉片NR活性顯著下降的結(jié)果一致。

托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成途徑與不飽和脂肪酸的生物合成途徑中的顯著富集代謝物隨著采收期的延遲，表達量呈下調(diào)變化。其中托品烷、哌啶和吡啶生物堿途徑中發(fā)生變化的腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶是合成煙堿的關(guān)鍵酶[39-40],而煙堿是煙草中特有的生物堿，是煙葉質(zhì)量形成的重要化合物[41]，說明延遲采收會抑制烤煙生物堿的合成與能量代謝，降低上部葉中生物堿含量，平衡上部煙葉內(nèi)在化學(xué)成分。亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸會增加煙葉的刺激性，對煙葉的品質(zhì)和風(fēng)味有重要的影響[42-43]。本研究中延遲采收過程中棕櫚油酸、油酸和亞麻酸等在不飽和脂肪酸合成途徑中呈下調(diào)表達，說明隨著上部煙葉的成熟，煙葉中高級脂肪酸含量呈大幅度降低趨勢。宮長榮等[44]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉內(nèi)棕櫚油酸、油酸和亞麻酸含量持續(xù)下降?？梢?，延遲采收能夠降低煙葉內(nèi)不飽和脂肪酸含量，降低上部煙葉的刺激性。

4 結(jié)論

本研究綜合生理和代謝組學(xué)兩個方面對延遲采收下的上部煙葉成熟度進行評價分析，發(fā)現(xiàn)延遲采收能夠減弱上部煙葉抗逆性、降低氮代謝，抑制不飽和脂肪酸的生物合成以及托品烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，減少煙葉刺激性，降低煙堿含量，糖類物質(zhì)含量在延遲8 d時積累量達到最高。由此可得出，豫中煙區(qū)上部葉延遲采收8 d時，煙葉生理和代謝方面達到采收最佳狀態(tài)。