番石榴結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響研究

謝 甜 孫 琳 范 偉 郭時(shí)印 肖 航,2 唐忠海,*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2 麻省大學(xué)阿莫斯特分校食品科學(xué)系，美國(guó) 馬薩諸塞州 阿莫斯特 01003)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一種重要的水果作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，味甜、質(zhì)地脆，富含多酚[1-2]、黃酮[3]、甾體激素[4]、維生素C、膳食纖維、胡蘿卜素、脂肪和氨基酸等多種活性物質(zhì)[5]。近年來(lái)，人們對(duì)番石榴的營(yíng)養(yǎng)成分、活性成分及藥理作用進(jìn)行了深入研究，使番石榴在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[6-7]。

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，主要存在于植物的皮、根、葉和果中。多酚有多種分類方式[8]，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，可將其分為簡(jiǎn)單酚類、酚酸類、單寧類、黃酮類、異黃酮類和萘醌類等類型[9]；根據(jù)多酚的結(jié)合方式可將其分為游離態(tài)多酚(free polyphenols，F(xiàn)P)和結(jié)合態(tài)多酚(bound polyphenols，BP)，F(xiàn)P是指通過(guò)簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑萃取就可以獲得的多酚；BP是需先通過(guò)化學(xué)或酶處理，破壞多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才能分離得到的多酚[10-11]。多酚具有抗氧化[12]、抗癌[13-14]，誘導(dǎo)基因表達(dá)[15]、降低血漿脂質(zhì)氧化產(chǎn)物濃度[16]等作用。紅心番石榴是番石榴的重要品種之一，其游離多酚、結(jié)合態(tài)多酚以及總多酚含量較高，抗氧化活性較強(qiáng)[17-20]。

腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能及其產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物對(duì)維持人體腸道健康具有重要意義[21]。它們通過(guò)發(fā)酵大腸中不可消化的膳食成分，為宿主提供營(yíng)養(yǎng)和能量，并促進(jìn)宿主的代謝和免疫系統(tǒng)保持平衡[22]。研究表明，腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成受環(huán)境、年齡、生理狀況、飲食等多種因素的影響，會(huì)在一定范圍內(nèi)波動(dòng)[23]。而失衡的腸道菌群不但會(huì)引起消化道的感染、炎癥等疾病，也會(huì)極大地增加人體罹患糖尿病、肥胖癥、消化道癌癥等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[24-25]。隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道菌群平衡被打破，有益菌尤其是以革蘭氏陽(yáng)性菌如雙歧桿菌為主的某些腸道菌群減少，有害菌增加[26]。

目前，針對(duì)番石榴結(jié)合態(tài)多酚的研究較少[27]。本研究以CD-1小白鼠為研究對(duì)象，采用灌胃的方法給予不同劑量的紅心番石榴結(jié)合態(tài)多酚，通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)[28-30]，研究結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，以期為番石榴結(jié)合態(tài)多酚的研究與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

30只4周齡健康CD-1雄性小鼠，許可證號(hào)SYXK(粵)2019-0136，SPF級(jí)，每只體重約20～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；紅心番石榴采自福建省漳州市詔安縣。

Nucleo Spin 96 Soi DNA提取試劑盒，德國(guó)Macherey Nagel公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)、福林酚(分析純)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Agilent-8453E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，德國(guó)安捷倫科技公司；MK-3酶標(biāo)儀，上海Thermo Labsystems公司；LC-10ATVP plus高效液相色譜儀，日本島津公司；9700型PCR儀，美國(guó)ABI公司；M2e多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 結(jié)合態(tài)多酚的提取 參照駱亞麗等[31]的方法，獲得紅心番石榴果渣，即結(jié)合態(tài)多酚。

1.3.2 結(jié)合態(tài)多酚不同組分分析 采用高效液相色譜-電離子噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry，HPLC-ESI-MS)法對(duì)結(jié)合態(tài)多酚不同組分進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)合態(tài)多酚樣品溶于甲醇溶液，進(jìn)樣量10 μL，濃度10 mg·mL-1，檢測(cè)前樣品溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，使用乙腈-水體系進(jìn)行梯度洗脫；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，采用負(fù)離子模式檢測(cè)，使用YMC C18色譜柱，流動(dòng)相：甲醇(A)/0.1%三氟乙酸水相(B)，流速：1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

對(duì)于神話、傳說(shuō)，咱老百姓就說(shuō)：“我給你說(shuō)說(shuō)這個(gè)某某神(鬼)的事兒吧，我給你說(shuō)說(shuō)那個(gè)某某神(鬼)的事吧?！毕裆裨挕髡f(shuō)、故事都是書面意義，老百姓們不那么說(shuō)。耿村一開(kāi)始還沒(méi)被發(fā)現(xiàn)的時(shí)候，周邊人說(shuō)耿村是“笑話村”，后來(lái)專家們證實(shí)后就改叫“故事村”。再后來(lái)大家總是聽(tīng)過(guò)來(lái)采訪的人、專家、學(xué)者們說(shuō)講個(gè)故事、傳說(shuō)之類，他們才把“笑話”改成“故事”或者“傳說(shuō)”。

1.3.3 動(dòng)物飼養(yǎng) 小鼠飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持溫度26±1℃，晝夜節(jié)律12 h/12 h，正壓通風(fēng)。小鼠可以自由飲食、飲水，動(dòng)物房所用的飼料、墊料、鼠籠、飲用水、飲水瓶均經(jīng)過(guò)高溫高壓消毒(121℃，60 min)。

1.3.4 動(dòng)物試驗(yàn) 將小鼠分為空白組、高濃度組(500 mg·kg-1)、低濃度組(100 mg·kg-1)，每組10只，共飼養(yǎng)5周，適應(yīng)期為1周，并按照5只1籠的原則分籠飼養(yǎng)，每5只小鼠將隔天輪轉(zhuǎn)至不同的籠子里以適應(yīng)環(huán)境，適應(yīng)期結(jié)束后，將小鼠隨機(jī)分組，以最大程度地消除可能存在的母體效應(yīng)。3組小鼠均食用AIN93G飼料，灌胃期間，分別于灌胃第1、第5、第9、第13、第17、第21、第25、第29天早晨空腹稱重，計(jì)算小鼠各生長(zhǎng)階段的平均日增重(average daily gain，ADG)[28]。

每天下午4點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，每只小鼠灌胃4 mL，空白組為無(wú)菌水，試驗(yàn)組為不同濃度的番石榴渣(結(jié)合態(tài)多酚)，灌胃2 h之后各組正常飲水，結(jié)合態(tài)多酚以無(wú)菌水溶解，振蕩搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 糞便收集 灌胃前一天、灌胃后第2周和灌胃結(jié)束當(dāng)天(第29天)收集新鮮糞便，分裝于無(wú)菌離心管內(nèi)，密封，-80℃凍存。在第5周試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠用濃度為1%(40 mg·kg-1)的戊巴比妥鈉麻醉，每組各收集小鼠糞便30 g以上(每只老鼠不少于3 g)，置于干燥滅菌試管中，于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.6 樣品處理 取出小鼠糞便樣品解凍，首先用糞便組基因DNA提取試劑盒提取DNA，電泳檢測(cè)合格后，選擇基因高變域V3-V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用酶標(biāo)儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，并進(jìn)行混合。構(gòu)建文庫(kù)后通過(guò)Illumina Miseq PE 300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[32]。

1.3.7 生物信息學(xué)分析 在0.97相似度下對(duì)序列聚類，每個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)代表一個(gè)物種，將OTU代表序列進(jìn)行物種注釋，并與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，統(tǒng)計(jì)樣本的群落結(jié)構(gòu)，獲得分類信息及相對(duì)豐度[33-34]，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)ACE、Shannon等指數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行α多樣性分析[35-36]，運(yùn)用主坐標(biāo)分析法進(jìn)行β多樣性分析[37]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)合態(tài)多酚各組分鑒定

如圖1所示，結(jié)合態(tài)多酚中有大量的多酚類物質(zhì)。通過(guò)HPLC-ESI-MS負(fù)離子掃描，根據(jù)色譜峰的相對(duì)分子量、化學(xué)式、碎片離子峰，以及文獻(xiàn)中報(bào)道的多酚碎片峰信息[38-39]，推測(cè)各峰代表的化合物： 1沒(méi)食子酸、2鞣花酸、3阿魏酸、4綠原酸、5對(duì)香豆酸、6番石榴苷。

圖1 結(jié)合態(tài)多酚的反相柱-液相色譜圖譜Fig.1 RP-HPLC spectrum of bound polyphenols

2.2 小鼠體重變化

由表1可知，灌胃組與空白組小鼠的體重差異不顯著(P>0.05)，表明結(jié)合番石榴態(tài)多酚不會(huì)對(duì)正常小鼠的體重造成顯著影響。

表1 結(jié)合態(tài)多酚灌胃期間小鼠體重變化(n=10)Table 1 Changes on body weight in mice during administration of bound polyphenols(n=10) /g

2.3 菌群α多樣性分析

反映物種數(shù)量即豐富度的指數(shù)包括Observed、Chao1和ACE指數(shù)。反映物種均勻性的指數(shù)包括Shannon和Simpson指數(shù)[40-41]。Observed指數(shù)越大說(shuō)明物種越豐富，Chao1和ACE指數(shù)的數(shù)值大小含義同理。

Shannon與Simpson指數(shù)的高低與群落多樣性的高低呈正向關(guān)系[42]。Coverage指每個(gè)樣本的覆蓋率，代表能檢測(cè)到序列的概率，數(shù)值越大說(shuō)明結(jié)果越貼近實(shí)際情況[43-44]，經(jīng)分析，3個(gè)試驗(yàn)組的Coverage都在99.9%以上，說(shuō)明測(cè)量結(jié)果能準(zhǔn)確反映真實(shí)情況。

如圖2和表2所示，與空白組相比，低濃度組中菌群的Observed(OTU)指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)均顯著提高(P<0.05)；但在高濃度組中菌群的這五類指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明低濃度組番石榴結(jié)合多酚能顯著提高小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性，促進(jìn)α多樣性，相反高濃度組會(huì)抑制α多樣性。

表2 α多樣性指數(shù)比較Table 2 Comparison of Alpha diversity indexs

注：“0”表示灌胃前期，“1”表示灌胃中期，“2”表示灌胃結(jié)束，“Blank”表示空白組，“Low”表示低濃度組，“High”表示高濃度組。下同。Note: ‘0’ means pre-gavage, ‘1’ means mid-gavage, ‘2’ means end of gavage, ‘Blank’ means blank group, ‘Low’ means low concentration group, and ‘High’ means high concentration group. The same as following.圖2 結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群α多樣性的影響Fig.2 The effect of bound polyphenols on Alpha diversity in mice

2.4 菌群β多樣性分析

主坐標(biāo)分析法(principal coordinates analysis，PCoA)是評(píng)估β多樣性的常用方式之一，根據(jù)不同的距離算法實(shí)現(xiàn)定性數(shù)據(jù)的定量轉(zhuǎn)換[36]。因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，反之則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)[37]。

由圖3可知，灌胃組與空白組樣本點(diǎn)分布的區(qū)域在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中(包括適應(yīng)期)基本都有交集，即灌胃組腸道細(xì)菌菌落與空白組無(wú)顯著差異，說(shuō)明結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

注：兩點(diǎn)之間距離越近表明二者的群落構(gòu)成差異越小。Note: The closer the distance between the two points, the smaller the difference in community composition between the two points.圖3 小鼠糞便微生物菌群主坐標(biāo)分析Fig.3 The principal coordinates analysis of microbial flora in mice feces

2.5 番石榴結(jié)合態(tài)多酚對(duì)腸道菌群物種組成的影響

2.5.1 基于門水平上的影響 由圖4可知，各組樣本腸道菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)5種菌門為主，相對(duì)豐度之和在95%以上，其中厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門3個(gè)菌門的相對(duì)豐度值最大。另外，由圖5、6可知，比例較高的還有脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)及1種未分類擬桿菌門(Patescibacteria)[45]。

圖4 小鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度的變化Fig.4 Relative abundance of mice intestinal flora at the phylum level

注:橫坐標(biāo)的第一個(gè)數(shù)字1，2，3分別代表灌胃前、中、結(jié)束期，第二個(gè)數(shù)字中的1～6、7～12、13～18分別代表空白組、低濃度組以及高濃度組。Note:The first number 1,2,3 on the abscissa represents the early, middle and end of gavaged administration respectively, and the 1 to 6, 7 to 12, 13 to 18 in the second number represents the blank group, low concentration group and high concentration group namely.圖5 所有樣品腸道菌群門水平的物種相對(duì)豐度Fig.5 Species relative abundance of all sample gut microbiota at the phylum level

注：圖中每一列表示一個(gè)樣本，每一行表示一個(gè)OTU，顏色深度表示OTU中包含的讀取數(shù)值，越接近紅色相對(duì)豐度越高。Note:Each column in the figure represents a sample, and each row represents an OTU. The colorrepresents the read value containedin the OTU. The closer is to the red, the higher the relative abundance is.圖6 腸道菌群門水平物種豐度聚類圖Fig.6 Species abundance cluster graph of intestinal flora at the phylum level

灌胃結(jié)束時(shí)，相對(duì)于空白組，高濃度組的厚壁菌門的相對(duì)豐度下降了19.23%，而低濃度組上升了7.30%。低濃度組和高濃度組擬桿菌門的相對(duì)豐度分別下降了1.27%和21.31%。疣微菌門的相對(duì)豐度則表現(xiàn)為低濃度組下降了7.66%，高濃度組上升了38.41%，疣微菌門在腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，其一些成員具有多糖水解酶活性[46]。低濃度組與高濃度組放線菌門的相對(duì)豐度分別上升了1.10%和0.30%；高低濃度組變形菌門的相對(duì)豐度分別上升了1.25%和0.20%。綜上所述，番石榴結(jié)合態(tài)多酚會(huì)導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響門水平菌群的相對(duì)豐度。

2.5.2 基于屬水平上的影響 由圖7可知，從小鼠糞便中鑒別出10個(gè)門96個(gè)屬，主要包括疣微菌門的艾克曼菌屬(Akkermansia)，厚壁菌門的乳桿菌屬(Lactobacillus)，瘤胃菌科(Ruminococcaceae)的未知屬Ruminiclostridium_9，擬桿菌門的擬桿菌屬(Bacteroides)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroides)，理研菌科(Rikenellaceae)的未知屬Rikenellaceae_RC9_gut_group及另枝菌屬(Alistipes)。其中艾克曼菌屬、乳桿菌屬和擬桿菌屬3個(gè)菌屬的相對(duì)豐度最高。

圖7 小鼠腸道菌群屬水平相對(duì)豐度的變化Fig.7 Relative abundance of mice intestinal flora at thegenus level

與空白組相比，低濃度結(jié)合態(tài)多酚處理艾克曼菌屬的相對(duì)豐度降低了7.66%，而高濃度組提高了38.41%，艾克曼菌屬屬于新抗癌明星細(xì)菌，在增加癌癥免疫治療效果上有非常顯著的作用，其豐度與幾種疾病狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，如炎癥性腸病、急性闌尾炎、2型糖尿病等[47-51]，有成為下一代益生菌的潛力[52]。大量研究表明，乳桿菌能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，具有改善胃腸道功能等多種有益功效[53]，其相對(duì)豐度在低濃度組中升高了1.85%，相反在高濃度組降低了2.15%；Tannock[54]和Hughes等[55]研究證明擬桿菌在腸道內(nèi)的增多會(huì)有致癌作用。高、低濃度組擬桿菌屬的相對(duì)豐度分別降低了13.69%和7.71%，說(shuō)明番石榴結(jié)合態(tài)多酚能夠調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌增長(zhǎng)，抑制有害菌增長(zhǎng)，且其作用效果與濃度密切相關(guān)，高低2種濃度的作用不完全相同。

3 討論

影響腸道菌群構(gòu)成和平衡的重要外在因素包括分娩方式[56]、膳食類型[57-58]和藥物治療[59]。大量研究表明，番石榴中的總多酚與游離態(tài)多酚[60-62]、番石榴葉提取物[63-64]、番石榴皮及其提取物[65-66]等均對(duì)人或小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用。除番石榴多酚外，綠茶多酚也會(huì)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用[67]。

多酚類物質(zhì)作為功能性物質(zhì)[68]，可通過(guò)為腸道內(nèi)微生物提供代謝底物及自身特性的發(fā)揮抑制腸道內(nèi)有害菌群的生長(zhǎng)，減少致病菌帶來(lái)的毒性[69-70]；同時(shí)，多酚類物質(zhì)可以抑制部分酶的活性，進(jìn)而影響腸道內(nèi)的一系列酶化反應(yīng)[71]。本研究在已有對(duì)番石榴總多酚與游離態(tài)多酚對(duì)腸道菌群的影響的研究基礎(chǔ)上，對(duì)結(jié)合態(tài)多酚的作用進(jìn)行了研究。采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，統(tǒng)計(jì)小鼠腸道菌群菌落結(jié)構(gòu)的分類信息及相對(duì)豐度，證明番石榴結(jié)合態(tài)多酚雖對(duì)小鼠腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，但能顯著提高小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性，促進(jìn)α多樣性，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，如改變厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、變形菌門、放線菌門5種優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度，提高有益菌艾克曼菌屬、乳桿菌屬的相對(duì)豐度，降低有害菌擬桿菌屬的相對(duì)豐度，改善腸道健康。游離態(tài)多酚作用已有文獻(xiàn)記載[72-73]，可見(jiàn)番石榴總多酚中的兩大成分均對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用。同時(shí)不同濃度的番石榴結(jié)合態(tài)多酚的作用不完全相同，如低濃度能顯著提高小鼠腸道菌群豐富度，高濃度卻無(wú)顯著作用；低濃度會(huì)降低有益菌艾克曼菌屬的相對(duì)豐度，高濃度則提高該菌屬相對(duì)豐度。該結(jié)果顯示，番石榴結(jié)合態(tài)多酚的濃度與其實(shí)際調(diào)節(jié)作用有著密切關(guān)系，過(guò)高過(guò)低都可能會(huì)造成不利的影響，后期研究應(yīng)擴(kuò)大番石榴結(jié)合態(tài)多酚濃度范圍及給藥樣本量，進(jìn)一步考察不同濃度的作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)，分析番石榴結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)番石榴結(jié)合態(tài)多酚對(duì)小鼠腸道菌群的豐富度和均勻性有明顯促進(jìn)作用，且對(duì)菌群結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)作用，既能提高益生菌比例，也能降低有害菌比例。另外，不同濃度番石榴結(jié)合態(tài)多酚對(duì)同一菌種造成的影響可能相同也可能相反，過(guò)高過(guò)低都可能會(huì)造成不利的影響。后期研究需進(jìn)一步考察更大范圍濃度對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，并探討其在降低血糖、血脂等方面的作用。