大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因As-1-SST的克隆與表達(dá)分析

鐵原毓 田 潔,2,*

(1 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

植物中果聚糖作為由蔗糖與一個(gè)或多個(gè)果糖基連接成的寡糖或多糖，不僅是許多高等植物營(yíng)養(yǎng)器官中重要的水溶性碳水化合物，還是一種滲透調(diào)節(jié)劑。果聚糖的解聚能釋放可溶性果糖，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，從而提高植物細(xì)胞抵御逆境的能力[1]。研究表明，果聚糖作為一種新興的抗氧化劑，其代謝過(guò)程不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還能夠通過(guò)穩(wěn)定膜系統(tǒng)保護(hù)植物免受冰凍或干旱脅迫[2-3]。因此，研究果聚糖合成相關(guān)基因，明確基因功能，對(duì)揭示植物抗逆機(jī)制具有重要意義。

蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST)作為植物果聚糖生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，通過(guò)將一個(gè)蔗糖分子上的果糖基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)蔗糖分子上，催化形成一個(gè)果聚三糖(1-蔗果三糖)和一個(gè)葡萄糖分子，使果聚糖開(kāi)始合成[4]。另外，1-SST作為果聚糖合成途徑中關(guān)鍵的第一步，對(duì)β(2-1)鍵連接的菊糖型果聚糖新生系列的合成具有重要的催化作用[5]。近年來(lái)，關(guān)于果聚糖合成相關(guān)基因功能的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，如小麥[6-7]、洋蔥[8]、華山新麥草[9]、蘆筍[10]、菊芋[11]等植物的1-SST基因已被克隆并進(jìn)行序列分析。研究表明，1-SST基因在植物合成果聚糖及抵御非生物脅迫中具有重要意義[12-14]，如在冬小麥中過(guò)表達(dá)1-SST基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性[15]；煙草中過(guò)表達(dá)萵苣1-SST基因，明顯增加了轉(zhuǎn)基因煙草果聚糖的積累，從而提高了植株耐旱性[16]。

大蒜(AlliumsativumL.)又名蒜、胡蒜，百合科蔥屬二年生草本植物，是世界范圍廣泛栽培的藥食兼用蔬菜[17]。大蒜喜好冷涼環(huán)境，但青海高原地區(qū)獨(dú)特的低溫、干旱等氣候通常使植物遭受環(huán)境因素的脅迫傷害，導(dǎo)致大蒜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[18-19]。而果聚糖作為大蒜中干物質(zhì)含量最高的貯存物質(zhì)[20]，能夠在逆境脅迫下通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓以提高植物抵御低溫、干旱等逆境的抗性，但關(guān)于1-SST基因參與大蒜響應(yīng)逆境過(guò)程的研究卻鮮有報(bào)道。目前大蒜基因組已測(cè)序完成[21]，但尚未公布1-SST基因相關(guān)注釋信息，其生物學(xué)功能也鮮見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以樂(lè)都紫皮大蒜為試驗(yàn)材料，對(duì)1-SST基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并研究該基因在不同組織、不同脅迫處理下的表達(dá)規(guī)律，旨在為進(jìn)一步解析大蒜1-SST基因在高原逆境脅迫下的響應(yīng)機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料樂(lè)都紫皮大蒜播種于含栽培基質(zhì)(草炭∶珍珠巖=1∶1)的盆缽中，在青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝所植物光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：25℃/15℃(14 h/10 h，白天/黑夜)，相對(duì)濕度70%。培養(yǎng)至大蒜植株長(zhǎng)出2～3片葉，且苗高10 cm左右時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、健壯的幼苗，每個(gè)處理選取3株。進(jìn)行如下處理：

(1)對(duì)照：培養(yǎng)條件不變，25℃/15℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，相對(duì)濕度70%，期間正常澆水；

(2)低溫脅迫處理：4℃/4℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，相對(duì)濕度70%，期間正常澆水；

(3)干旱脅迫處理：25℃/15℃ (14 h/10 h，白天/黑夜)，參照前期研究[22]通過(guò)停止?jié)菜M(jìn)行人工控水，保持空氣相對(duì)濕度30%，通過(guò)烘干稱重法[23]控制土壤相對(duì)濕度在45%～55%。

低溫和干旱脅迫處理時(shí)間分別為0、4、12、24 h和0、1、3、9 d，每個(gè)處理3次重復(fù)。分別取大蒜根、假莖、葉片和鱗芽各0.5 g，立即用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?，用于RNA的提取以及cDNA的合成。

總RNA提取試劑 (TRNzol Universal, DP424)、大腸桿菌菌種DH5α，北京天根生化科技有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及引物，上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒載體pMD19-T Vector Cloning Kit，大連TaKaRa公司；高保真酶 (Unique HiQTMPfu DNA Polymerase)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR)和熒光定量試劑盒 (Unique AptamerTMQpcr SYBR?Green Master Mix)，北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 將經(jīng)過(guò)低溫和干旱脅迫處理的不同時(shí)期大蒜根、假莖、葉片和鱗芽材料利用TRNzol Universal總RNA提取試劑提取總RNA，通過(guò)HonorTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒將大蒜根、假莖、葉片及鱗芽總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 大蒜As-1-SST基因的克隆 根據(jù)課題組建立的大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布)，檢索得到蔗糖：蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列。設(shè)計(jì)一對(duì)克隆引物As-1-SST-F (5′-A T G T C T T C C G A T G A C C T A G A A T C A C C-3′)和As-1-SST-R (5′-T C A C A T C A T G C T G G T A G C A G G A T-3′)，以樂(lè)都紫皮大蒜鱗莖cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×Unique HiQTM PCR Buffer 25 μL，模板cDNA 1 μL，PfuDNA聚合酶1 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，陽(yáng)性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得洋蔥等其他植物的1-SST序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析；采用ExPaSy(https://web.expasy.org/protparam/)軟件分析氨基酸基本成分、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；采用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Softberry (http://linux1.softber-ry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)在線軟件分別預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位。利用SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu) (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)；通過(guò)Phyre 2軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu) (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。使用NCBI中的BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對(duì)，預(yù)測(cè)As-1-SST蛋白質(zhì)保守區(qū)。使用MEGA6.0對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行測(cè)試和編輯，生成報(bào)告圖形。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)按照試劑盒操作說(shuō)明在Roche LightCycler?480 Ⅱ(Roche，美國(guó))上進(jìn)行。以大蒜CYP基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物為CYP-F: 5′-A A G G A C G A G A A C T T C A T C-3′，CYP-R: 5′-T C A A T A T C T C T C A C C A C T T C-3′。根據(jù)克隆得到的果聚糖合成酶基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物1-SST-F: 5′-T C G G G T A T G T G G G A A T G T-3′和1-SST-R: 5′-T G G T C G C T C A A A G T A T C G-3′，目的基因與內(nèi)參基因一起擴(kuò)增。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以大蒜CYP基因作為定量表達(dá)分析的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜果聚糖合成酶基因As-1-SST的克隆

以樂(lè)都紫皮大蒜的鱗莖cDNA為模板，分別以As-1-SST-F和As-1-SST-R作為上游和下游引物，PCR擴(kuò)增后得到1條長(zhǎng)度約為2 000 bp的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，As-1-SST基因編碼序列(coding sequences, CDS)全長(zhǎng)為1 872 bp，編碼623個(gè)氨基酸(圖2)。將該基因序列上傳至GenBank，獲得登錄號(hào)為MW767832。

注：M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2 000 bp)。Note: M: DNA marker(2 000 bp).圖1 大蒜As-1-SST基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 As-1-SST gene amplified by RT-PCR from garlic

注：*: 終止密碼子。Note: *: Stop codon.圖2 大蒜As-1-SST基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequences and predicted amino acid sequences of As-1-SST gene from garlic

2.2 大蒜As-1-SST蛋白的理化性質(zhì)分析

ExPaSy-ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果表明As-1-SST蛋白分子式為C3168H4790N812O929S20，分子量為69 756.97 Da，理論等電點(diǎn)為5.19，親水性平均系數(shù)為-0.195，是一個(gè)穩(wěn)定性蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為36.64)；SignaIP 3.0 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽，不屬于分泌型蛋白；TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白有一個(gè)跨膜螺旋區(qū)，其位置在39～40(圖3)；As-1-SST蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白定位于液泡的可能性較大。

圖3 大蒜As-1-SST蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the transmembrane domain of As-1-SST protein

2.3 大蒜As-1-SST的氨基酸親水性和疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)DNAMAN 7.0對(duì)大蒜As-1-SST基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行親水性/疏水性分析。結(jié)果表明(圖4)，該蛋白的第366位賴氨酸(Lys)親水性最強(qiáng)；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第41位的亮氨酸(Leu)，其次為第32位的亮氨酸(Leu)。

圖4 大蒜As-1-SST氨基酸序列的親水性和疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophilcity and hydrophobicity of amino acid sequences of As-1-SST from garlic

2.4 大蒜As-1-SST的蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對(duì)As-1-SST蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5-A所示。As-1-SST的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(15.27%)、延伸結(jié)構(gòu)(23.63%)、β-轉(zhuǎn)角(4.66%)和無(wú)規(guī)則卷曲(56.43%)構(gòu)成。利用Phyre 2軟件進(jìn)行同源建模，并通過(guò)PyMOL軟件分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5-B)，結(jié)果顯示As-1-SST蛋白模型構(gòu)建基于模板c3ugfB(富貴草6-SST/6-SFT)，可信度100%，覆蓋率85%，且大蒜As-1-SST蛋白的三維結(jié)構(gòu)由6個(gè)α-螺旋和34個(gè)β-折疊所構(gòu)成。

圖5 As-1-SST蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary and tertiary structure prediction of As-1-SST protein

2.5 大蒜As-1-SST的保守域分析與同源性序列比對(duì)

在NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)中將大蒜As-1-SST的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，由圖6可知，As-1-SST包含2個(gè)糖苷水解酶32(GH32)家族的特異位點(diǎn)，且其N-端Pfam攜帶糖苷水解酶的5個(gè)葉片β-螺旋結(jié)構(gòu)域，表明As-1-SST屬于糖苷水解酶32(GH32)家族。

圖6 大蒜As-1-SST氨基酸序列保守域預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of conserved domain and amino acid sequences of As-1-SST from garlic

將大蒜As-1-SST氨基酸序列分別與洋蔥(AlliumcepaL., CAA06838.1)、太匱龍舌蘭(AgavetequilanaL., ABG00265.1)、蘆筍(AsparagusofficinalisL., BAM66575.1)、菊芋(HelianthustuberosusL., CAA08812.1)、菊苣(CichoriumintybusL., AAB58909.1)、高粱(SorghumbicolorL. Moench, XP_021314410.1)、洋薊(Cynaracardunculusvar. scolymus, CAA70855.1)、高羊茅(Loliumarundinaceum, CAC05261.1)、掃帚黍(Dichantheliumoligosanthes, OEL25428.1)、糜子(PanicummiliaceumL., RLN09014.1)、藥用蒲公英(Taraxacumofficinale, CAB60153.1)、小米(SetariaitalicaL. Beauv., XP_004951208.1)、黑麥草(LoliumperenneL., AAO86693.1)、大麥(HordeumvulgareL., AFP72238.1)、黑麥(SecalecerealeL., AFK29572.1)、普通小麥(TriticumaestivumL., BAB82470.1)和硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp. Durum, ACH73196.1)等植物的1-SST氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析(圖7)，序列比對(duì)的一致性達(dá)到64.80%，大蒜As-1-SST氨基酸序列與這17個(gè)物種具有較高的同源性，表明不同物種的1-SST氨基酸序列的保守性較高，但在長(zhǎng)度和氨基酸組成上存在差異性。結(jié)果表明，不同物種1-SST蛋白都具有糖基水解酶32家族的保守結(jié)構(gòu)域，其中大蒜As-1-SST蛋白β-果糖苷酶基序(NDPNG)中N和G存在變異，RDP、EC結(jié)構(gòu)域與其他已報(bào)道物種1-SST蛋白結(jié)構(gòu)域完全一致。

注：加紅色邊框部分表示3個(gè)保守區(qū)域。Note: The red boxes indicate the three conserved regions.圖7 大蒜As-1-SST與其他植物1-SST氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.7 The alignment of amino acid sequences of 1-SST from garlic and other plant species

對(duì)大蒜和其他植物的1-SST氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。由表1可知，這些植物中的1-SST氨基酸殘基數(shù)為621～677個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為69.55～73.42 kDa，理論等電點(diǎn)在4.87～5.92之間，酸性氨基酸比例(包括天冬氨酸和谷氨酸)總體略高于堿性氨基酸(包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，脂肪族氨基酸比例相對(duì)較高，而芳香族氨基酸比例較低，不同氨基酸序列理化性質(zhì)存在差異。

表1 不同植物的1-SST氨基酸組成及理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of amino acid composition and physicochemical properities of 1-SST from different plants

2.6 大蒜As-1-SST的進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法將大蒜與其他17種不同植物的1-SST構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)(圖8)。結(jié)果顯示，大蒜As-1-SST與百合科的洋蔥、石蒜科的太匱龍舌蘭和天門冬科的蘆筍1-SST在進(jìn)化上屬于同一個(gè)分支，且與同科同屬的洋蔥在進(jìn)化關(guān)系上最為接近。而禾本科中普通小麥、硬粒小麥、黑麥、大麥、高羊茅、黑麥草、高粱、掃帚黍、糜子、小米的1-SST屬于同一個(gè)分支，洋薊、菊芋、菊苣和藥用蒲公英的1-SST同屬于菊科分支。

圖8 As-1-SST氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of As-1-SST amino acid sequence

2.7 大蒜As-1-SST基因在不同組織和逆境條件下的表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR對(duì)As-1-SST基因在樂(lè)都紫皮大蒜不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明(圖9)，在正常條件下As-1-SST基因在大蒜根、假莖、葉片和鱗芽中均有表達(dá)，其中，在根中表達(dá)水平最高，其次是假莖，在鱗芽和葉片中表達(dá)水平較低。

注：不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖9 As-1-SST基因在大蒜不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.9 Relative expression levels of As-1-SST gene in different garlic tissues

為了進(jìn)一步研究As-1-SST基因?qū)Ω咴婢趁{迫的響應(yīng)，對(duì)低溫和干旱脅迫下的大蒜根、假莖、葉片及鱗芽進(jìn)行qRT-PCR分析。由圖10可知，低溫和干旱脅迫均可以顯著誘導(dǎo)或抑制As-1-SST基因的表達(dá)。

注：A, E:根; B, F:假莖; C, G:葉片; D, H:鱗芽。Note: A, E: Root. B, F: Pseudostem. C, G: Leaf. D, H: Scale bud.圖10 低溫和干旱脅迫下As-1-SST基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.10 Relative expression levels of As-1-SST gene under low temperature and drought stress in garlic

低溫脅迫處理下，大蒜As-1-SST基因在根中的表達(dá)水平與處理0 d相比顯著降低，且處理4 h時(shí)的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的19.30%；相反，As-1-SST在假莖、葉片和鱗芽中的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照條件下該基因的表達(dá)量。低溫培養(yǎng)過(guò)程中，假莖的As-1-SST表達(dá)量隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈“升-降-升”的變化趨勢(shì)，且低溫處理4、12和24 h時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，分別為對(duì)照的5.75、7.20和1.79倍；葉片中As-1-SST的表達(dá)隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降的變化趨勢(shì)，表達(dá)量在低溫處理4、12和24 h時(shí)均顯著高于對(duì)照，且在12 h達(dá)峰值，為對(duì)照的6.77倍；As-1-SST在鱗芽中的表達(dá)量在低溫處理4 h迅速升高，并保持在較高水平，至24 h時(shí)升至最高，為對(duì)照的17.37倍?？芍蜏孛{迫顯著提高了大蒜假莖、葉片及鱗芽中As-1-SST的表達(dá)水平，從低溫處理4 h開(kāi)始，脅迫能夠誘導(dǎo)大蒜假莖、葉片、鱗芽進(jìn)行果聚糖的合成。

與低溫處理相比，大蒜各組織As-1-SST對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)差別明顯。整個(gè)處理過(guò)程中，除了大蒜鱗芽，其他組織的As-1-SST表達(dá)量從未顯著高于對(duì)照。隨著干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜As-1-SST基因在根和假莖中的表達(dá)量呈先升后降的趨勢(shì)但整體均顯著低于0 d。干旱脅迫1 d時(shí)，As-1-SST在根中的表達(dá)量最低，為對(duì)照的16.74%；干旱脅迫3 d時(shí)As-1-SST在假莖中的表達(dá)量最低，為對(duì)照的14.45%。在葉片中，As-1-SST的表達(dá)雖然隨干旱脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降的變化趨勢(shì)，但其表達(dá)量除在1 d時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異外，其余均顯著低于對(duì)照。與以上大蒜組織不同，干旱能夠提高鱗芽的As-1-SST表達(dá)水平。As-1-SST在鱗芽中的表達(dá)隨干旱脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)呈“降-升-降”的變化趨勢(shì)，干旱脅迫3 d時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的5.52倍；而干旱脅迫1和9 d時(shí)表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異?？芍狝s-1-SST對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)具有明顯的組織特異性，干旱處理對(duì)大蒜鱗芽中As-1-SST的誘導(dǎo)更加明顯。

3 討論

生長(zhǎng)在青藏高原的園藝作物，經(jīng)常會(huì)遭受低溫、干旱等多種不利環(huán)境因素的脅迫，引起植物組織脫水、細(xì)胞膜功能異常、電解質(zhì)滲漏等現(xiàn)象，逆境最終導(dǎo)致植物減產(chǎn)、局部傷害或全株死亡[24-25]。青海地處青藏高原，氣候冷涼，具有大蒜生長(zhǎng)及干物質(zhì)積累的良好氣候優(yōu)勢(shì)[18]。然而青海春季干旱和凍害的頻繁發(fā)生，導(dǎo)致淺根作物大蒜的生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響。果聚糖作為大蒜中干物質(zhì)含量最高的貯存物質(zhì)，是大蒜產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素，同時(shí)作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，果聚糖的積累有利于增強(qiáng)植物的抗旱及抗寒能力[26-27]。1-SST作為果聚糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物果聚糖合成中起重要調(diào)控作用。因此，研究1-SST不僅有利于闡明植物果聚糖合成相關(guān)基因表達(dá)水平及其抵御逆境脅迫的分子機(jī)制，也對(duì)改善高原逆境下大蒜植株的生存能力具有實(shí)際生產(chǎn)意義。

本研究從大蒜中克隆獲得一個(gè)果聚糖合成關(guān)鍵酶基因As-1-SST，其CDS全長(zhǎng)為1 872 bp，編碼623個(gè)氨基酸，分子量為69.76 kDa，理論等電點(diǎn)為5.19。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)As-1-SST蛋白定位于液泡的可能性較大，其在細(xì)胞中具體位置需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。與其他物種氨基酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的As-1-SST蛋白N端差異比較明顯，但C端保守性較高，說(shuō)明不同植物的1-SST蛋白功能存在一定的相似性和專一性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜As-1-SST蛋白的NDPNG發(fā)生了2次變異，由GDPNA組成，這與Tita等[28]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)洋蔥的1-SST由ADPNA組成，說(shuō)明β-果糖苷酶基序(NDPNG)在果糖基轉(zhuǎn)移酶中通常是可變的。保守域分析顯示As-1-SST基因所推導(dǎo)的氨基酸屬于糖苷水解酶32(GH32)家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，大蒜As-1-SST氨基酸序列與百合科同屬的洋蔥親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)90.69%；其次是石蒜科的龍舌蘭和天門冬科的蘆筍，說(shuō)明同起源于百合目的物種之間遺傳距離較近。此外，大蒜As-1-SST氨基酸序列與禾本科、菊科等物種的1-SST氨基酸序列處于不同分支，說(shuō)明不同物種1-SST基因功能可能存在一定的再分化。因此，克隆大蒜As-1-SST基因?yàn)楹罄m(xù)基因功能驗(yàn)證研究提供了理論基礎(chǔ)。

目前，已經(jīng)從多種植物中克隆了與果聚糖合成相關(guān)的1-SST等基因，并發(fā)現(xiàn)這些基因在植物抗逆過(guò)程中的功能。低溫脅迫下，積累了更多果聚糖的黑麥草植物在細(xì)胞水平上具有更高的耐凍性[29]。干旱脅迫下，高產(chǎn)果聚糖甜菜株系中1-SST基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量上升，顯著提高了植株抗旱性[30]。此外，研究表明同一基因在不同組織中的響應(yīng)逆境的表達(dá)量差異顯著[31]。張園等[10]研究蘆筍(AsparagusofficinalisL.)成株花期不同器官的1-SST基因表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在果聚糖積累和合成運(yùn)輸部位，Ao1-SST基因的表達(dá)量最高。在龍舌蘭植物中，低聚果糖主要積累于葉組織，而高聚果糖主要在莖中積累[32]。上述研究表明，1-SST基因可能在不同植物抗逆過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，然而有關(guān)大蒜中1-SST基因響應(yīng)逆境脅迫的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究為了進(jìn)一步研究大蒜各組織以果聚糖為主要貯藏物質(zhì)的分子機(jī)制，對(duì)高原逆境脅迫下As-1-SST基因在不同組織的響應(yīng)情況進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明在低溫脅迫和干旱脅迫下該基因在根、假莖、葉片、鱗芽等不同組織中的響應(yīng)存在差異；低溫脅迫4 h時(shí)，能夠誘導(dǎo)大蒜除根部以外的大部分組織進(jìn)行果聚糖的合成，其中該基因在葉片中的表達(dá)量是對(duì)照的9.17倍，這可能與大蒜在低溫脅迫下，葉片最先做出響應(yīng)有關(guān)；然而，干旱脅迫只顯著提高了大蒜鱗芽中As-1-SST的基因表達(dá)量，在脅迫3 d時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照的5.52倍，說(shuō)明As-1-SST對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)具有明顯的組織特異性。綜上可知，As-1-SST基因在大蒜抵御高原逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮較大作用，本研究為進(jìn)一步探討該基因如何具體調(diào)控大蒜抗寒和抗旱機(jī)制提供了參考。

4 結(jié)論

大蒜As-1-SST基因全長(zhǎng)1 872 bp，編碼623個(gè)氨基酸，屬于糖苷水解酶32(GH32)家族，與百合科洋蔥親緣關(guān)系最接近。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，As-1-SST在根中表達(dá)最高，其次是假莖，在鱗芽和葉片中表達(dá)水平較低，具有明顯的組織特異性；且在低溫脅迫和干旱脅迫下該基因在不同組織中響應(yīng)存在差異，低溫處理4 h時(shí)顯著提高了假莖、葉、鱗芽中As-1-SST的表達(dá)，干旱處理對(duì)大蒜鱗芽中As-1-SST的誘導(dǎo)則更加明顯，說(shuō)明As-1-SST基因可能在大蒜抵御低溫干旱脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其具體抗逆作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。