萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響和機(jī)制研究

柴 燃 ， 秦 鵬 ， 吳 迪 ， 季紹東 ， 薛 強(qiáng) ， 程鑫穎

（1.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲 056250；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院邯鄲市天然產(chǎn)物與功能性食品開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北邯鄲 056107；3.河北省植物資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），河北邯鄲 056107）

現(xiàn)代畜牧業(yè)對(duì)產(chǎn)量和效率的要求越來(lái)越高，通常使用抗生素如土霉素（孫盛明，2020）、桿菌肽鋅（Engberg，2000）、金霉素（張憬，2016）等獲得高水平產(chǎn)出， 但考慮到其對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境的影響（包櫻鈺，2021），全球范圍內(nèi)一直存在監(jiān)管、限制抗生素在飼料上的使用。 為了在沒(méi)有藥物的情況下保證動(dòng)物的健康、快速生長(zhǎng)，需要高質(zhì)量的飼料成分和飼料添加劑。 其中，有機(jī)酸由于對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)效率的積極影響而被廣泛使用（潘寶海，2019）。

萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物是在提取萬(wàn)壽菊菊花中葉黃素的過(guò)程中，通過(guò)綜合利用得到的，其主要成分為乳酸。 乳酸具有廣譜的抑制細(xì)菌和抗真菌能力， 常作為添加劑添加到飼料中（Tugnoli，2020）。 因此，為了解萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物作為飼料添加劑的功效， 本試驗(yàn)研究了其對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、胃內(nèi)容物pH 及腸道微生物的影響，旨在為萬(wàn)壽菊資源的綜合利用和萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物由晨光生物技術(shù)集團(tuán)股份有限公司提供，乳酸（AR級(jí)別） 購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠，MH 培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)公司，鹽酸萬(wàn)古霉素、阿莫西林購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。 在萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸中加入二氧化硅制成固態(tài)制劑，并使兩種制劑的總酸（以乳酸計(jì)）含量相當(dāng)。

1.2 最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn) 96 孔板中每孔加入MH 肉湯培養(yǎng)基100 μL。在第1 列加配好的藥液100 μL，然后對(duì)藥物進(jìn)行二倍稀釋。 即第一孔中加入 100 μL 藥液（400 mg/mL）后用移液槍吹打使藥物與培養(yǎng)基充分混勻，然后吸取100 μL加入第二孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照此重復(fù)直至最后倒數(shù)第二孔，吸出100 μL 扔掉。第12 列作為空白對(duì)照組（加菌液不加藥液）。再在每一孔中加入稀釋好的菌液100 μL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后，觀察結(jié)果。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 剛斷奶的SPF 級(jí)雄性昆明小鼠 （周齡 3 周，19 ～ 21 g）50 只購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±3）℃，濕度 30% ～ 70%，自由飲食飲水，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。 小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按體重隨機(jī)對(duì)小鼠進(jìn)行分組，做好標(biāo)記。 1 組為對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)2、3、4 組分別在基礎(chǔ)日糧中添加 2、1.5、1.0 g/kg 的萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物， 試驗(yàn)5 組添加1.5 g/kg 乳酸，每組 10 只（分 2 籠），試驗(yàn)周期為 14 d。 鼠籠根據(jù)抽簽結(jié)果隨機(jī)擺放， 避免生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo) 分別于試驗(yàn)開(kāi)始喂養(yǎng)的第0、7、14 天空腹稱(chēng)重，按照下列公式計(jì)算各生長(zhǎng)階段的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.4.2 胃內(nèi)容物pH 稱(chēng)取胃內(nèi)容物0.2 g， 加入6 mL 純水，振蕩?kù)o置10 min 后測(cè)上清液pH。

1.4.3 胃蛋白酶活性 取小鼠的胃黏膜組織勻漿上清液樣本，利用BCA 法測(cè)定其蛋白含量，通過(guò)催化血紅蛋白分解法測(cè)定小鼠胃黏膜胃蛋白酶的活性，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.4 胰島素樣生長(zhǎng)因子 （IGF-1） 小鼠眼眶取血， 室溫靜置之后，3000 r/min 離心獲得血清，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中IGF-1 含量。

1.4.5 腸道菌群測(cè)序 每組選取5 只小鼠， 分別取小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物置于試管中，干冰寄送北京諾禾致源科技股份有限公司對(duì)16S rDNA 進(jìn)行測(cè)序，比較不同組間的差異。

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 21.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用one-way ANOVA 比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)細(xì)菌的抑制能力 如表2 所示，萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌和沙門(mén)氏菌的MIC 和市售產(chǎn)品A 相同，對(duì)大腸桿菌的抑制作用稍弱于市售產(chǎn)品A?？傮w來(lái)說(shuō)，萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物與市售產(chǎn)品A 差別不大，具有作為飼料酸化劑的應(yīng)用潛力。

表2 不同液態(tài)有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度 μg/mL

2.2 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響由表3 可知，在試驗(yàn)第一周，與對(duì)照組相比，不同試驗(yàn)組的采食量沒(méi)有明顯差別； 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物高劑量組（試驗(yàn)2 組）和乳酸組（試驗(yàn)5 組）的平均日增重較對(duì)照組分別提升16.8%、10.8%（P ＜0.05），其余試驗(yàn)組平均日增重都高于對(duì)照組但不具有顯著性差異（P ＞ 0.05）；試驗(yàn) 5 組 0 ~ 7 d 的料重比與對(duì)照組相比，降低10.4%。 試驗(yàn)第二周，試驗(yàn)組的采食量較對(duì)照組均降低，其中試驗(yàn)2、4、5 組較對(duì)照組分別降低 8.9%、4.0%和9.3%（P ＜0.05）；試驗(yàn)2 組和試驗(yàn)5 組平均日增重較對(duì)照組降低18.0%和11.8%（P ＜0.05），試驗(yàn)組料重比較對(duì)照組無(wú)顯著差異（P ＞ 0.05）。

表3 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.3 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠胃內(nèi)容物pH 的影響 由表4 可知， 對(duì)照組小鼠的胃內(nèi)容物pH最高，所有試驗(yàn)組的胃內(nèi)容物pH 均低于對(duì)照組，試驗(yàn) 2、4、5 組的 pH 較 1 組分別降低 1.39、1.19和 1.21（P ＜ 0.05），試驗(yàn) 3 組降低 0.53（P ＞ 0.05）。與對(duì)照組相比， 各試驗(yàn)組的小鼠胃蛋白酶活性和IGF-1 含量無(wú)顯著差異（P ＞ 0.05）。

表4 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠胃內(nèi)容物pH、胃蛋白酶活性和IGF-1 的影響

2.4 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物對(duì)小鼠腸道菌群的影響利用16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物進(jìn)行菌群分析，選取試驗(yàn)1 組（對(duì)照組）、試驗(yàn)3 組（萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物組）和試驗(yàn)5 組（乳酸組）對(duì)小鼠不同部位腸道內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)序，確定萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物能否通過(guò)改變腸道菌群影響小鼠生長(zhǎng)性能。 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Anosim 分析表明，萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物組、乳酸組與對(duì)照組相比，只有小腸菌群的變化具有顯著性 （P < 0.05），盲腸和結(jié)腸的菌群結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差異 （P > 0.05）（表 5）。

表5 Anosim 組間差異分析

小鼠腸道菌群中， 在門(mén)水平上占據(jù)主導(dǎo)地位的菌群是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)，兩者相加能達(dá)到腸道細(xì)菌豐度的90%以上。 對(duì)照組厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值為0.69，乳酸組為1.65，萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物中劑量組為1.68， 表明乳酸和萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物喂養(yǎng)斷奶期小鼠都會(huì)增加小腸中厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值（表6）。

表6 不同組小鼠腸道細(xì)菌在門(mén)水平上的相對(duì)豐度

3 討論

飼料添加劑主要分為酸、益生元、植物產(chǎn)品、益生菌和礦物質(zhì)等（奚玉蓮，2020）。 其中，酸是代替抗生素的最佳選擇之一（Liu，2018）。在飼料上，酸最早用作酸化劑和防腐劑， 部分有機(jī)酸能參與三羧酸循環(huán)，調(diào)節(jié)微生物菌落構(gòu)成，意味著有機(jī)酸不再被視為飼料的簡(jiǎn)單酸化劑， 而是生長(zhǎng)促進(jìn)劑和潛在的抗生素替代品（Ferronato，2020）。 乳酸最早從酸奶中分離得到， 具有良好的抗細(xì)菌和抗真菌特性。 研究表明，乳酸能參與三羧酸循環(huán)，和丙酮酸的作用類(lèi)似（Rabinowitz，2020）。 乳酸還能促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)（徐青青，2020；蔣俊劼，2019），廣泛作為飼料添加劑使用。在生產(chǎn)葉黃素過(guò)程中，采摘的萬(wàn)壽菊花需要用乳酸菌進(jìn)行青貯 （李大婧，2008）。 為充分開(kāi)發(fā)萬(wàn)壽菊資源，利用萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)和小鼠喂養(yǎng)試驗(yàn)。 MIC試驗(yàn)表明， 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物與市售酸化劑具有相同的抑菌能力。 小鼠試驗(yàn)研究表明， 在喂養(yǎng)第一周， 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物高劑量組和乳酸組的小鼠平均日增重顯著高于對(duì)照組（P < 0.05），料重比顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），采食量沒(méi)有顯著差異（P > 0.05），說(shuō)明萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠促進(jìn)斷奶期小鼠的生長(zhǎng)；在第二周，高劑量萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸反而降低小鼠的采食量， 可能是由于降低了飼料的適口性。 根據(jù)高劑量組在第一周和第二周結(jié)果的不同， 表明要根據(jù)動(dòng)物的生長(zhǎng)時(shí)期在飼料中添加不同的劑量。

為探究萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)的原因，對(duì)小鼠胃內(nèi)容物的pH、胃黏膜的蛋白酶活性和血清中的IGF-1 進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果表明萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠降低小鼠胃內(nèi)容物的pH， 對(duì)黏膜組織中胃蛋白酶活性和血清中的IGF-1 沒(méi)有影響。剛斷奶的幼齡動(dòng)物，胃部發(fā)育不完善（Suiryanrayna，2015），會(huì)出現(xiàn)胃酸分泌不足，影響胃蛋白酶的激活， 導(dǎo)致食物消化困難（Ahmed，2014）。 也有證據(jù)表明，高 pH 會(huì)增加胃排空率，從而減少飼料在胃中的消化時(shí)間（Rayner，2012）。本研究表明，在飼料中添加萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物能降低小鼠胃內(nèi)部的pH， 激活胃蛋白酶，促進(jìn)消化吸收。

腸道菌群是個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)， 也是腸道的重要組成部分，與動(dòng)物的消化吸收、健康狀況關(guān)系密切（唐強(qiáng)，2020）。Lee（2018）研究證明，乳酸可通過(guò)加速腸道干細(xì)胞的分化促進(jìn)腸道的發(fā)育， 本研究表明， 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠顯著改變小腸部位的菌群結(jié)構(gòu)， 增加小腸細(xì)菌中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，對(duì)盲腸和結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)影響不大。 擬桿菌門(mén)及厚壁菌門(mén)是腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)有益菌，Turnbaugh 等（2007）發(fā)現(xiàn)，肥胖與擬桿菌門(mén)及厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度的改變存在關(guān)系，通過(guò)與瘦人進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)胖人腸道中厚壁菌門(mén)的相對(duì)比例有所增多， 這與小鼠試驗(yàn)結(jié)果一致。 能夠增加小鼠小腸中厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)細(xì)菌比例，促進(jìn)腸道的消化和能量吸收，也是萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物和乳酸能夠降低小鼠料重比的原因。

4 結(jié)論

萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物可作為酸化劑在飼料中添加，可通過(guò)抑制有害菌生長(zhǎng)，降低胃內(nèi)容物的pH幫助食物消化，促進(jìn)腸道發(fā)育，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和提高小鼠的生長(zhǎng)性能。 萬(wàn)壽菊發(fā)酵提取物在動(dòng)物的不同生長(zhǎng)期需要添加不同劑量， 斷奶初期需要較高劑量，后期要降低添加量。