飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃動態(tài)發(fā)酵和抗氧化能力的影響

孫 康， 劉繪匯， 范慧玉， 劉 婷， 鄭 琛

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

硝酸鹽不僅可以用作非蛋白氮的來源， 還可以改變反芻動物胃腸道內(nèi)環(huán)境和血清指標(biāo)。 反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對其自身健康至關(guān)重要。動物在采食含有硝酸鹽的飼糧后， 硝酸鹽在瘤胃內(nèi)通過微生物的作用，先被還原成亞硝酸鹽，最終生成氨態(tài)氮（Lewis 等，1951）。在這個過程中，硝酸鹽還原需要消耗氫， 由于丙酸合成中也需要氫的參與， 因此氫的減少會抑制丙酸產(chǎn)生而促進乙酸生成。除此之外，氫的減少也有助于緩解對纖維降解菌的抑制作用（Zijderveld 等，2010）。 硝酸鹽代謝的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽具有較強的氧化能力，可降低機體內(nèi)抗氧化因子和機體抗氧化能力（Kohn，2002）。 但目前有關(guān)硝酸鹽的研究大都集中在甲烷減排方面， 對湖羊瘤胃動態(tài)發(fā)酵和血清抗氧化指標(biāo)影響的研究較少。因此，本試驗將在飼糧中添加硝酸鈣， 研究其對湖羊瘤胃動態(tài)發(fā)酵和血清抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與動物 試驗采用交叉試驗設(shè)計。選擇安裝有永久瘤胃瘺管湖羊6 只， 隨機分為2組，每組3 只，每只為一個重復(fù)。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂添加3%硝酸鈣的飼糧。試驗分2 期進行，每期15 d，其中過渡期10 d，正試期5 d。

1.2 試驗飼糧 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T816-2004）進行飼糧配制， 所用飼糧均由甘肅潤牧生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)加工。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試羊采用單籠飼養(yǎng)，試驗開始后自由采食、自由飲水。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集

1.3.1 瘤胃液采集 正試期第4、5 天采集食后0、1、3、5 h 和 7 h 的瘤胃液。將試羊瘤胃瘺管塞去除后用燒杯接取瘤胃食糜，然后用4 層紗布過濾，過濾后的瘤胃液裝入15 mL 離心管， 隨后立即在-80 ℃進行保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和氨態(tài)氮的測定。

1.3.2 動態(tài)pH 數(shù)據(jù)采集 參考胡紅蓮等（2009）的方法測定瘤胃動態(tài)pH。 在每期試驗正試期前2天， 采用動態(tài)pH 監(jiān)測系統(tǒng)對試羊瘤胃pH 進行24 h 動態(tài)監(jiān)測。在每次進行動態(tài)pH 連續(xù)監(jiān)測時，用pH 4.00 和pH 6.86 標(biāo)準(zhǔn)液對電極進行校準(zhǔn)，并記錄校準(zhǔn)值。待電極校準(zhǔn)完畢后，將電極通過瘤胃瘺管插入瘤胃內(nèi)，然后塞好塞子。電極通過導(dǎo)線與瘺管外的pH 變送器信號輸入端相連，pH 變送器的信號輸出端與記錄儀的信號輸入端相連接。

本試驗用3 個通道進行實時顯示， 每期6 只試羊的pH 動態(tài)變化分2 d 完成， 并設(shè)定每隔 1 min 記錄1 次pH。然后將所記錄的數(shù)據(jù)通過動態(tài)pH 監(jiān)測系統(tǒng)專用U 盤上傳到電腦， 并運用DTM數(shù)據(jù)管理軟件將U 盤里的數(shù)據(jù)調(diào)出， 并存至Excel 文檔內(nèi)進行分析處理。

1.3.3 血清樣品采集 正試期后2 天， 試羊頸靜脈采血，使用非抗凝管采集食后 0、1、3、5 h 和 7 h的血液并制備血清。 血清轉(zhuǎn)入2 mL 離心管后置-80 ℃冰箱保存，用于抗氧化指標(biāo)測定。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 瘤胃液中VFA 的測定 瘤胃液5000 r/min離心10 min 后取1 mL 上清液置于1.5 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%的偏磷酸溶液（含內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸）， 充分混勻后置于冰水浴30 min 以上，然后再10000 r/min 離心10 min，取出離心管后，用移液槍移取上清液于氣相小瓶后上機測定。

使用安捷倫 6890N 氣相色譜儀和HP19091N-213 色譜柱測定VFA。 色譜分析條件為：進樣口溫度為220 ℃，分流比為40:1，氮氣流量為2.0 mL/min。檢測器溫度為250 ℃，空氣流量為450 mL/min，氮氣流量為45 mL/min，氫氣流量為 40 mL/min。 程序升溫：初溫為 120 ℃ 3 min，后以 10 ℃/min 升溫至 180 ℃，并保持 1 min。進樣量為 0.6 μL。

1.4.2 瘤胃液中氨態(tài)氮的測定 參考王世琴（2013）的方法測定瘤胃液中氨態(tài)氮含量。 瘤胃液5000 r/min 離心10 min 后移取1 mL 上清液轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中， 加入4 mL 0.2 moL 鹽酸后搖勻。然后吸取混合液0.2 mL，置于5 mL 離心管內(nèi)，依次加入A 液 （含有0.08 g 亞硝基鐵氰化鈉的100 mL 14%水楊酸鈉溶液）1 mL 和B 液（含有2 mL 次氯酸鈉溶液的100 mL 0.3 moL NaOH 溶液）1 mL，充分搖勻， 靜置 10 min。 然后移取 200 μL 混勻液置于 96孔板中， 使用酶標(biāo)儀測定波長700 nm 下的吸光度值。根據(jù)氨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線計算瘤胃液中氨態(tài)氮含量。

1.4.3 瘤胃中動態(tài)pH 的測定 將每天每只羊所采集的pH 數(shù)據(jù)進行匯總，計算平均值、最大值、最小值，以及pH 低于 5.60 和5.80 的持續(xù)時間及曲線面積。曲線面積是指pH 閾值與低于pH 閾值偏差絕對值累積之和與時間間隔的乘積， 單位為pH·min/d。 并計算每小時平均pH，用于繪制24 h動態(tài)pH 變化圖。

1.4.4 血清抗氧化指標(biāo)的測定 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所） 測定血清中的谷胱甘肽過氧化物酶 （GSHPx）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）和總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力。

1.5 數(shù)據(jù)處理 所測數(shù)據(jù)用Excel 整理， 并使用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行一般線性混合模型單變量方差分析， 以P ≤0.05 表示組間差異顯著，以0.05< P <0.1 表示組間有差異顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃液VFA 和氨態(tài)氮濃度的影響 由表2 可以看出， 飼糧添加硝酸鈣組湖羊瘤胃液中乙酸/總酸的比例和氨態(tài)氮的濃度顯著升高（P ＜0.05）；丙酸/總酸的比例顯著降低（P ＜0.05）。湖羊食后1 h 瘤胃液總酸的含量顯著高于 0 h 和 7 h（P ＜ 0.05）；食后丙酸/總酸的比例顯著高于0 h， 且處理與時間產(chǎn)生顯著的交互作用（P ＜ 0.05）；食后乙酸/丙酸比顯著低于 0 h，且處理與時間產(chǎn)生顯著的交互作用（P ＜0.05）。處理與時間對湖羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度產(chǎn)生了顯著的交互作用（P ＜0.05）。 此外，硝酸鈣有升高湖羊瘤胃液乙酸/丙酸比的趨勢（P =0.068）。

表2 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃液VFA 和氨態(tài)氮濃度的影響

2.2 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃動態(tài)pH 的影響 由表3 可以看出， 飼糧添加硝酸鈣組湖羊瘤胃動態(tài) pH 的最小值顯著降低（P ＜0.05），但其他動態(tài) pH 兩組間無顯著差異（P ＞ 0.05）。 從表 3 和圖1 可以看出， 硝酸鈣使湖羊瘤胃pH 維持在較高水平且pH 低于5.60 和5.80 的時間短于對照組湖羊（P ＞ 0.05）。

圖1 湖羊瘤胃pH 24 h 動態(tài)變化

表3 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃動態(tài)pH 的影響

2.3 飼糧添加硝酸鈣對湖羊血清抗氧化能力的影響 由表4 可以看出， 飼糧添加硝酸鈣組湖羊血清 T-AOC 活力顯著降低（P =0.05）；與 0 h 相比，食后（1、3、5、7 h）血清 GSH-Px 活力顯著降低（P ＜0.05），且隨采食時間呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，食后5 h GSH-Px 含量降至最低。 處理與時間對湖羊血清抗氧化能力沒有產(chǎn)生顯著的交互作用（P ＞ 0.05）。

表4 飼糧添加硝酸鈣對湖羊血清抗氧化能力的影響

3 討論

3.1 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃液VFA 和氨態(tài)氮濃度的影響 反芻動物瘤胃發(fā)酵是否正常決定了動物自身的健康生長發(fā)育狀況， 瘤胃發(fā)酵過程中產(chǎn)生的VFA 和氨態(tài)氮等參數(shù)可以反映反芻動物瘤胃發(fā)酵狀況。 飼糧中的碳水化合物在反芻動物瘤胃內(nèi)經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生VFA （譚建華等，2012），通過分析VFA 的組成和比例，可以了解瘤胃的發(fā)酵模式和發(fā)酵程度（郭艷霞等，2020）。林淼等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，在湖羊飼糧中添加硝酸鉀可以顯著提高瘤胃氨態(tài)氮、 總微生物蛋白和乙酸的含量，降低丁酸含量，使發(fā)酵趨于乙酸發(fā)酵模式。Sharifi 等（2019）也報道，飼糧添加硝酸鹽可以降低綿羊瘤胃液中 VFA 的含量。 在 Asanuma 等（2015）的試驗中，山羊飼糧添加硝酸鹽顯著降低了瘤胃液總VFA，顯著提高了乙酸/丙酸比及氨態(tài)氮和乳酸的濃度。 Meller 等（2019）也發(fā)現(xiàn)，飼喂NO3-的奶牛瘤胃乙酸/丙酸比更高。 Villar 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，肉牛飼糧中添加硝酸鹽以后對瘤胃液總VFA 無影響，但增加了乙酸的比例。 趙麗萍（2015）的研究也發(fā)現(xiàn)，肉牛飼糧添加硝酸鹽可提高瘤胃液乙酸比例。 Mamvura 等（2014）的體外試驗表明， 發(fā)酵底物加入硝酸鹽可降低發(fā)酵液中總VFA， 但可提高發(fā)酵液中氨態(tài)氮的濃度。Zhou 等（2011）研究也表明，硝酸鈉可升高48 h瘤胃體外發(fā)酵液中乙酸/丙酸比，使發(fā)酵模式趨向于乙酸型。這些研究結(jié)果都與本試驗中，硝酸鈣可顯著升高湖羊食后1、3 h 和5 h 瘤胃液中乙酸/總酸比例，顯著提高食后5 h 乙酸/丙酸比的結(jié)果一致。 這是由于硝酸鹽在瘤胃內(nèi)經(jīng)亞硝酸鹽生成氨態(tài)氮的過程中（Lewis 等，1951），可通過消耗氫而抑制丙酸生成， 并有助于纖維降解菌的增殖（Zijderveld，2010）。 但 Zhang 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，用尿素+硝酸鹽預(yù)處理水稻和小麥秸稈可以提高丙酸的含量；且Ellis 等（2008）認(rèn)為，硝酸鹽可以降低氫分壓， 促進還原輔因子 （NADH、NADPH 和FADH）的進一步氧化，進而提高VFA 產(chǎn)量。 然而大部分試驗結(jié)果表明，硝酸鹽對奶牛（van Wyngaard 等，2019；Olijhoek 等，2016）和綿羊（Adejoro等，2020）瘤胃液 VFA 無顯著影響。 因此，硝酸鈣對湖羊瘤胃發(fā)酵的調(diào)控作用及其機理還有待進一步研究。

在本試驗中， 硝酸鈣組湖羊食后 1、3、5 h 瘤胃液中氨態(tài)氮濃度顯著提高。 硝酸鹽作為一類含氮類化合物， 可給反芻動物瘤胃微生物的發(fā)酵提供氮源（Wang 等，2018），從而提高瘤胃液氨態(tài)氮濃度。林淼等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，湖羊飼糧中添加硝酸鉀可顯著提高氨態(tài)氮濃度。 Asanuma 等（2015）報道， 山羊飼糧添加硝酸鹽可以提高瘤胃液中氨態(tài)氮濃度。 劉麗慧等（2017）利用薩能奶山羊瘤胃液進行體外發(fā)酵， 也發(fā)現(xiàn)硝酸鹽提高了發(fā)酵液中氨態(tài)氮的濃度。 這些試驗結(jié)果與本試驗研究結(jié)果一致。但Capelari 等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鹽可以降低半連續(xù)瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)中氨態(tài)氮的濃度；且Zhao 等（2015）發(fā)現(xiàn)，飼糧添加硝酸鹽不會影響肉牛瘤胃液中氨態(tài)氮的濃度。

3.2 飼糧添加硝酸鈣對湖羊瘤胃動態(tài)pH 的影響 在本試驗中， 飼糧添加硝酸鈣組湖羊瘤胃動態(tài)pH 的最小值顯著降低， 但平均pH 有所提升。瘤胃pH 是反芻動物瘤胃發(fā)酵的一項重要指標(biāo)，其是否處于正常范圍內(nèi)， 會直接影響瘤胃發(fā)酵的效果（Nocek 等，2002）。 反芻動物瘤胃正常 pH 一般在5.5 ~ 7.5， 超過這個范圍就會對動物產(chǎn)生不良影響。 張藝邀（2018）認(rèn)為，瘤胃 pH 過低會影響瘤胃微生物菌群，刺激瘤胃黏膜和降低瘤胃蠕動。楊淑青等（2013）也認(rèn)為，瘤胃pH 過低不利于纖維分解菌的生長，影響其對養(yǎng)分的消化吸收，并且瘤胃長期處于較低pH 環(huán)境中會破壞其上皮細(xì)胞。 但研究發(fā)現(xiàn)， 硝酸鹽具有調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃pH 的作用 （Henry 等，2020； 董在坤等，2019；Granja-Salcedo 等，2019；陳志遠等，2016；Lee 等，2015）。 硝酸鹽在反芻動物瘤胃內(nèi)水解后，硝酸鹽還原菌在硝酸鹽還原酶的作用下利用H+將NO3-還原為 NO2-（Iwamoto 等，2002），NO2-隨即在微生物的作用下生成NH4+。 在本試驗中，對照組湖羊食后瘤胃pH 先降低后上升， 而硝酸鈣組湖羊食后瘤胃pH 先升高后降低， 也與NO3-在瘤胃內(nèi)的氧化還原降解機制一致。反芻動物瘤胃pH 5.2 通常被作為急性酸中毒的臨界點，將5.6 和5.8 作為亞急性酸中毒的臨界點 （Penner 等，2007；Yang等，2006）。 本試驗中，硝酸鈣對湖羊瘤胃液 pH 低于5.80 和5.60 的維持時間和曲線面積有降低作用，說明硝酸鈣具有緩解湖羊酸中毒的作用。

3.3 飼糧添加硝酸鈣對湖羊血清抗氧化能力的影響 動物體內(nèi)含有大量的超氧陰離子自由基，在正常情況下處于動態(tài)平衡狀態(tài)。 但在動物生長發(fā)育過程中， 可由外部和自身等原因引發(fā)氧化應(yīng)激， 動物在代謝過程中會在體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基， 其超強的氧化性降低機體抗氧化能力 （Yin 等，2013）， 從而導(dǎo)致動物機體出現(xiàn)疾?。⊿ies 等，1997）。 本試驗研究結(jié)果表明，硝酸鈣組湖羊食后5 h 血清MDA 含量提高，食后7 h 血清T-AOC 活力降低，表明飼糧中的硝酸鈣不利于湖羊維持正常的抗氧化能力， 可能與3%的添加劑量有關(guān)。 趙麗萍（2015）研究發(fā)現(xiàn)，肉牛飼糧添加2%硝酸鹽不會影響機體抗氧化能力。但有關(guān)硝酸鹽較高添加水平對動物機體抗氧化能力影響的報道較少，還需要進一步研究。 此外，硝酸鹽在反芻動物瘤胃代謝過程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽具有很強的氧化能力，能夠攻擊動物機體氧化防御系統(tǒng)，使動物發(fā)生中毒現(xiàn)象 （Kohn 等，2002）。 Al-Qudah（2010）的研究也證實了這點，奶牛飼糧添加硝酸鹽以后使奶牛出現(xiàn)慢性中毒的現(xiàn)象， 并且血清中抗氧化酶的活性降低。研究還發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加硝酸鹽可以降低血清中抗氧化物質(zhì)的含量和增加活性氧含量（Xian 等，2012；Tabacova 等，1998）。

4 小結(jié)

硝酸鈣可以改變湖羊瘤胃發(fā)酵類型， 提高瘤胃液乙酸/總酸比例和氨態(tài)氮的含量，且處理與時間表現(xiàn)出顯著的交互作用； 硝酸鈣可使湖羊瘤胃液pH 維持在較高水平；但飼糧中添加3%硝酸鈣能降低湖羊的抗氧化能力。