丁酸梭菌介導(dǎo)mTOR 信號(hào)通路調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制

李玉鵬 ， 李?；? ， 郭曉飛 ， 姚大為 ， 李義海 ， 馮 婧 ， 張金龍 ， 張效生

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青 300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津西青 300384）

丁酸梭菌（CB）是畜牧業(yè)中的替抗產(chǎn)品之一，不僅能夠減少養(yǎng)殖過程中抗生素的使用， 保證食品安全，且其作為一種重要的益生菌，還能夠?yàn)闄C(jī)體提供多種可利用的營養(yǎng)物質(zhì)， 提高機(jī)體的抗炎能力以及免疫力等（Li 等，2018；Liao 等 2015）。 但有關(guān)丁酸梭菌介導(dǎo)雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制仍不十分清楚。因此，本研究通過丁酸梭菌作用于豬腸上皮細(xì)胞 （IPEC-J2）， 研究丁酸梭菌介導(dǎo)mTOR信號(hào)通路調(diào)控產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 感染IPEC-J2 炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制， 為揭示丁酸梭菌調(diào)節(jié)生豬健康的分子機(jī)制， 促進(jìn)生豬養(yǎng)殖的健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和菌株 豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88（ETEC K88）為天津師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO 等常用細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購自美國Gibco 公司。 豬腫瘤壞死因子（TNF-α）和豬白細(xì)胞介素-8 （IL-8） 檢測試劑盒均購自美國BD 公司。DNA 和RNA 核酸萃取試劑盒、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購買于美國GeneCpoeia 公司。 mTOR 抑制劑（ab142151）購自英國Abcam 公司。

1.3 CB 對 ETEC 感染 IPEC-J2 后促炎性細(xì)胞因子及mTOR 相對表達(dá)量的影響 試驗(yàn)分為3組，即空白對照組（不進(jìn)行處理）、ETEC 組（ETEC刺激細(xì)胞）、CB+ETEC 組 （按順序使用 CB、ETEC K88 刺激細(xì)胞），每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為 80%（每孔 2 × 106個(gè)細(xì)胞）， 使用 CB （1 × 107cfu/mL） 預(yù)處理細(xì)胞3 h， 然后使用最佳劑量的ETEC（1 × 103cfu/mL）作用 IPEC-J2 細(xì)胞 3、6、12 h 和24 h，到達(dá)作用時(shí)間后，分別收集細(xì)胞及用無菌管收集培養(yǎng)上清， 3000 r/min 離心20 min，然后按照豬腫瘤壞死因子 （TNF-α） 和豬白細(xì)胞介素-18（IL-18）檢測試劑盒說明書進(jìn)行促炎性細(xì)胞因子的檢測。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測mTOR 和 GAPDH mRNA 水平的相對表達(dá)量。 收集的細(xì)胞樣品總RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及qPCR 相對定量法 2-△△Ct的計(jì)算參照 Qiao 等（2020）的方法。相關(guān)引物序列見表1。

1.4 mTOR 信號(hào)通路在 CB 減輕 ETEC 造成IPEC-J2 損傷中的作用 試驗(yàn)分為7 組， 即空白對照組（不進(jìn)行處理）、DMSO 組（10 μmol/L DMSO 刺激細(xì)胞）、 抑制劑組 （抑制劑刺激細(xì)胞）、ETEC 組（ETEC 刺激細(xì)胞）、抑制劑+ETEC 組（按順序用抑制劑、ETEC 刺激細(xì)胞）、CB+ETEC 組（按順序使用 CB、ETEC 刺激細(xì)胞）、 抑制劑+CB+ETEC 組（按順序使用抑制劑、CB、ETEC K88 刺激細(xì)胞）。 將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為 80%（每孔 2 × 106個(gè)細(xì)胞）， 用 400 nmol/L 的mTOR 抑制劑處理細(xì)胞1 h， 置換培養(yǎng)液，然后用 CB（1 × 107cfu/mL）處理細(xì)胞 3 h，再用 ETEC K88（1 × 103cfu/mL）處理 IPEC-J2 6 h，到達(dá)作用時(shí)間后，分別收集細(xì)胞及用無菌管收集培養(yǎng)上清，3000 r/min 離心20 min， 然后按照豬腫瘤壞死因子（TNF-α）和豬白細(xì)胞介素-8（IL-8）檢測試劑盒說明書進(jìn)行促炎性細(xì)胞因子的檢測。 ZO-1、occludin、mTOR 和 GAPDH mRNA 水平的相對表達(dá)量，檢測方法同上。 相關(guān)引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2007 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理； 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因子方差分析 （one-way ANOVA，LSD）， 采用 GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行圖像處理及分析。 P < 0.05 為差異顯著，P < 0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果及分析

2.1 促炎性細(xì)胞因子及mTOR 相對表達(dá)量的測定 由圖 1 可知，與對照組相比，在 3、6、12、24 h時(shí)，ETEC 組 TNF-α 和 IL-8 的含量以及 mTOR的相對表達(dá)量均顯著或者極顯著升高 （P ＜0.05，P ＜ 0.01），TNF-α 的含量分別升高了 75.31%、153.04%、431.60 和 550.66%，IL-8 的含量分別升高 了 117.41% 、284.12% 、734.56 和 822.58% ，mTOR 的相對表達(dá)量分別升高了21.03% 、23.11%、67.08%和 103.00%； 與 ETEC 組相比，在6、12、24 h 時(shí)，CB+ETEC 組 TNF-α 和 IL-8 的含量以及mTOR 的相對表達(dá)量均顯著或者極顯著降低 （P ＜ 0.05， P ＜ 0.01），TNF-α 的含量分別降低了18.76%、40.48%和43.65%，IL-8 的含量分別降低了37.15%、43.36%和48.24%，mTOR 的相對表達(dá)量分別降低了11.62%、25.00%和28.36%；結(jié)果表明，在ETEC K88 攻毒后，激活了mTOR 信號(hào)通路，而 CB 能夠顯著（P ＜ 0.05）或極顯著（P ＜0.01）降低IPEC-J2 炎癥反應(yīng)。

圖1 ETEC K88 感染 IPEC-J2 后炎癥反應(yīng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律

2.2 丁酸梭菌對mTOR 信號(hào)通路抑制劑處理IPEC-J2 后促炎性細(xì)胞因子含量的影響 由圖2可知，與對照組相比，DMSO 組和抑制劑組TNF-α和 IL-8 的含量均無顯著變化 （P > 0.05），ETEC組 TNF-α 和 IL-8 的含量均極顯著升高 （P <0.01），分別升高了202.64%和258.07%。 與ETEC組相比， 抑制劑組、 抑制劑+ETEC 組、CB+ETEC組和抑制劑+CB+ETEC 組 TNF-α 和 IL-8 的含量均極顯著降低 （P < 0.01），TNF-α 的含量分別降低了 68.28%、34.05%、29.46%和 38.35%，IL-8 的含 量 分 別 降 低 了 74.27% 、25.68% 、42.82% 和44.68%。 與 CB+ETEC 組相比，抑制劑+CB+ETEC組在mTOR 活性被抑制后TNF-α 和IL-8 的含量呈下降趨勢但差異不顯著 （P > 0.05），TNF-α 的含量降低了12.61%，IL-8 的含量降低了3.26%。試驗(yàn)結(jié)果表明，CB 和靶蛋白抑制劑共同作用，或CB 單獨(dú)作用均能夠降低ETEC K88 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子（TNF-α 和IL-8）的產(chǎn)生，且靶蛋白抑制劑對CB 調(diào)控促炎性細(xì)胞因子的生成具有協(xié)同作用。

圖2 CB 對 ETEC K88 感染 IPEC-J2 后炎癥因子含量的影響

2.3 丁酸梭菌對mTOR 信號(hào)通路抑制劑處理IPEC-J2 中相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響 由圖3可知，與對照組相比，DMSO 組和抑制劑組ZO-1、occludin 和mTOR mRNA 水平的相對表達(dá)量均無顯著變化 （P > 0.05），ETEC 組 ZO-1 和 occludin的表達(dá)量均極顯著降低 （P < 0.01）， 分別降低了45.01%和28.57%，而mTOR 的表達(dá)量極顯著升高（P < 0.01），升高了 23.04%。 與 ETEC 組相比，抑制劑組、 抑制劑+ETEC 組、CB+ETEC 組和抑制劑+CB+ETEC 組ZO-1 和 occludin 的表達(dá)量均顯著（P < 0.05）、極顯著（P < 0.01）升高，或有升高趨勢，ZO-1 的表達(dá)量分別升高了89.64%、86.59%、31.48%和133.98%，occludin 的表達(dá)量分別升高了 50.68%、69.34%、18.63%和 87.52%， 而 mTOR的表達(dá)量分別降低了58.11%、40.81%、11.62%和52.43%。 與 CB+ETEC 組相比，抑制劑+CB+ETEC組在mTOR 活性被抑制后ZO-1 和occludin 的表達(dá)量極顯著（P < 0.01）升高了77.97%和58.07%，而mTOR 的表達(dá)量極顯著降低了46.18%。試驗(yàn)結(jié)果表明，ETEC K88 感染能夠引起細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá)量下降，但是CB 能夠激活mTOR 信號(hào)通路， 并與抑制劑協(xié)同逆轉(zhuǎn)ETEC K88 感染造成的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

圖3 CB 對 ETEC K88 感染 IPEC-J2 后mTOR 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響

3 討論

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌 （如大腸桿菌K88）引起的一種豬腸道傳染病，主要危害仔豬腸道健康（Luppi，2017）。 雖然利用抗生素能夠有效預(yù)防該病的發(fā)生， 但其長期使用也產(chǎn)生了諸多的負(fù)面效應(yīng)（Cameron-Veas 等，2016）。 丁酸梭菌能夠分泌多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有高效、無毒、無害、無殘留等飼料添加劑特點(diǎn)， 在降低動(dòng)物細(xì)菌耐藥性和保障動(dòng)物健康方面有著重要意義， 目前我國畜牧生產(chǎn)中已在逐步推廣應(yīng)用該益生菌。

3.1 丁酸梭菌對ETEC 感染IPEC-J2 后促炎性細(xì)胞因子含量及mTOR 表達(dá)量的影響 mTOR是蛋白質(zhì)生物合成的基礎(chǔ)，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用 （陳宗海等，2017）。mTOR 受生長因子、氧化應(yīng)激等因素調(diào)控，參與細(xì)胞周期素D1 等基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)翻譯起始、 細(xì)胞骨架形成等多種生物學(xué)功能 （Zhuo 等，2018；Zhou 等，2018 ；Holmes 等，2016）。 研究表明，雷帕霉素減輕大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的機(jī)制可能與抑制mTOR 信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制NLRC4 炎癥小體活性有關(guān)（陳令楠等，2020）。本研究表明，在對 IPEC-J2 進(jìn)行 ETEC K88 攻毒一定時(shí)間后，能夠產(chǎn)生顯著的炎癥反應(yīng)，激活了mTOR 信號(hào)通路， 而CB 能夠顯著減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

3.2 丁酸梭菌對mTOR 信號(hào)通路抑制劑處理IPEC-J2 后促炎性細(xì)胞因子含量的影響 炎癥反應(yīng)是機(jī)體的一種自我保護(hù)， 通常機(jī)體的炎癥反應(yīng)與抗炎癥反應(yīng)是處于平衡狀態(tài)的 （李玉鵬等，2017）。 TNF-α 和 IL-8 是評(píng)判機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)（Feng 等 2016；Liu 等，2009）。 TNF-α對免疫應(yīng)答具有一定的調(diào)節(jié)作用， 機(jī)體產(chǎn)生適量的TNF-α 時(shí)，能夠加速損傷組織的修復(fù)、抵抗病原感染等，但過量的TNF-α 則導(dǎo)致機(jī)體免疫平衡紊亂（李海花等，2019）。 IL-8 是一種較強(qiáng)的趨化性活性因子， 在機(jī)體腸道發(fā)生的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用， 并與外來病原體等刺激物誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)的改變相關(guān)（Rostami 等，2013）。 研究表明， 雷帕霉素能夠通過抑制mTOR-ULK1 通路減輕足細(xì)胞損傷（吳玲玲，2012）。 本研究表明，CB 與mTOR 抑制劑共同作用，或CB 單獨(dú)作用均降低了ETEC K88 誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子TNF-α 和 IL-8 的產(chǎn)生，且 mTOR 抑制劑對 CB 調(diào)控促炎性細(xì)胞因子的生成具有協(xié)同作用。

3.3 丁酸梭菌對mTOR 信號(hào)通路抑制劑處理IPEC-J2 后相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響 腸上皮細(xì)胞間緊密連接是參與控制細(xì)胞旁滲透的關(guān)鍵分子，在調(diào)節(jié)腸黏膜屏障通透性中發(fā)揮重要作用（Li等，2016；Zhang 等，2016；Zou 等，2016）。緊密連接由多個(gè)蛋白組成，其中閉合小環(huán)蛋白（ZO）和閉鎖蛋白（occludin）均為重要的緊密連接蛋白（Li 等，2016），其表達(dá)量的提高有助于減輕腸道損傷（Zou等，2016）。抑制劑 Wort 可顯著降低 IPEC-J2 細(xì)胞Akt、mTOR、ZO-1、occludin 和 claudin-1 mRNA 水平的表達(dá)， 因此推測PI3K-Akt-mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是GLP-2 調(diào)控腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)的重要信號(hào)通路之一（余長松等，2015）。研究表明，胰高血糖素樣肽-2（GLP-2）能夠通過PI3k/Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路，提高 IPEC-J2 中緊密連接 ZO-1 和 occludin 的表達(dá)（Qi 等，2017）。 葛根素能抑制mTOR 磷酸化， 調(diào)節(jié)mTOR 信號(hào)通路， 加強(qiáng)大鼠黏膜細(xì)胞的修復(fù)， 減輕肝臟損傷（Zhou 等，2018）。 本研究表明，ETEC 感染 IPECJ2 后，導(dǎo)致細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin表達(dá)量下降，但是CB 能夠激活mTOR 信號(hào)通路，并與抑制劑協(xié)同逆轉(zhuǎn)ETEC K88 感染造成的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

4 結(jié)論

丁酸梭菌通過介導(dǎo)mTOR 信號(hào)通路能夠降低ETEC K88 感染IPEC-J2 引起的炎癥反應(yīng)，并提高緊密連接蛋白的表達(dá)量， 為促進(jìn)丁酸梭菌在生豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。