人染色體端粒酶基因、TCT結(jié)合HPV檢測(cè)用于宮頸組織病變的診斷價(jià)值

靳夢(mèng)杰，胡 倩，李 強(qiáng)，吳 輝

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重危害女性身體健康，全球每年約50萬(wàn)新發(fā)病例，其中14萬(wàn)出現(xiàn)在中國(guó)，占全球新發(fā)病例28%。相比于發(fā)達(dá)國(guó)家，發(fā)展中國(guó)家宮頸癌病死率和發(fā)病率都高，因此，選取有效方式進(jìn)行早期預(yù)防、控制十分重要[1，2]。近年，我國(guó)女性子宮頸癌篩查研究工作逐步深入，子宮頸癌預(yù)后狀況得到顯著改善，選取有效方式擴(kuò)大篩查范圍，提升疾病篩查特異度和敏感度為疾病防治的關(guān)鍵。文獻(xiàn)[3]報(bào)道：宮頸癌和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有關(guān)，其中HPV18、HPV16為最常見(jiàn)類型，且也和人染色體端粒酶(human chromosome telomerase, hTERC)基因異常有一定關(guān)系。現(xiàn)階段常用宮頸癌篩查方式為液基薄層細(xì)胞檢測(cè)(liquid based thin layer cell assay，TCT)、HPV，之后隨著分子病理學(xué)技術(shù)持續(xù)發(fā)展，hTERC基因診斷技術(shù)也被應(yīng)用于臨床疾病診斷[4]。本研究旨在探討hTERC基因、TCT結(jié)合HPV檢測(cè)用于宮頸組織病變的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2019-09至2020-11我院收治的宮頸組織病變篩查患者150例，年齡24～61歲，平均(35.19±2.20)歲。以病理學(xué)作為金標(biāo)準(zhǔn)，可分為炎癥29例，宮頸癌前病變(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)1、2、3級(jí)(依次為37例、42例、30例)，浸潤(rùn)癌12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受篩查之前無(wú)性生活；(2)未進(jìn)行陰道沖洗或者盆?。?3)處于非月經(jīng)期和妊娠期；(4)未接受子宮切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期接受宮頸手術(shù)；(2)有盆腔疾病放射治療史；(3)合并畸形陰道炎。

1.2 方法

1.2.1 取材 清洗宮頸分泌物，使用窺陰器充分暴露宮頸，使用無(wú)菌干棉球擦洗宮頸表面分泌物，使用專用積液細(xì)胞學(xué)檢查毛刷置于宮頸鱗狀上皮細(xì)胞和柱狀上皮交接位置進(jìn)行細(xì)胞刷取，主要以宮頸外口為中心，以順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)3周，進(jìn)而取出宮頸刷，之后將細(xì)胞裝于保存液小瓶?jī)?nèi)，一份樣本進(jìn)行TCT檢測(cè)，另一份樣本進(jìn)行hTERC基因檢測(cè)。在進(jìn)行標(biāo)本采集時(shí)需嚴(yán)格避免月經(jīng)期前后3 d。采集標(biāo)本過(guò)程中發(fā)生出血時(shí)需清洗好棉簽將宮頸擦洗干凈后繼續(xù)采集。采集細(xì)胞前要求患者24 h內(nèi)禁止同房或者盆浴之后進(jìn)行陰道沖洗、用藥。器械也需干凈整潔，不可使用肥皂水或者乙醇等各種潤(rùn)滑劑，樣本采集時(shí)保存溫度低于4 ℃且保存時(shí)間低于7 d。

1.2.2 TCT 主要使用英碩新柏氏膜式液基薄層細(xì)胞制作技術(shù)，使用ThinPrep2000自動(dòng)制片機(jī)，使用95%乙醇進(jìn)行固定，巴氏染色，于光鏡下進(jìn)行閱片。采用2001年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS(The Bethesda System)分類標(biāo)準(zhǔn)診斷。

1.2.3 HPV 使用第二代雜交捕獲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，并通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)，化學(xué)發(fā)光放大基因信號(hào)微孔板測(cè)量病毒，HPV-DNA負(fù)荷率≥1.0 ng/L可判定為陽(yáng)性。

1.2.4 hTERC基因 TCT涂片、HR-HPV檢測(cè)后剩余液體離心處理。hTERC位點(diǎn)擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒依據(jù)熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行刮片、預(yù)處理、變性、雜交、洗滌。單個(gè)間期細(xì)胞核內(nèi)紅色、綠色信號(hào)各兩個(gè)為正常，綠色、紅色信號(hào)多于或少于兩個(gè)可判定為擴(kuò)增異常陽(yáng)性。

1.2.5 陰道鏡和病理診斷 其中三種不同診斷方式任意方式顯示為陽(yáng)性，則需接受陰道鏡活檢。診斷為宮頸癌、宮頸上皮瘤變時(shí)判定為宮頸惡性病變。病理切片至少由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片，兩名醫(yī)師結(jié)果判定一致之后方可作為最終判定結(jié)果，必要時(shí)請(qǐng)上級(jí)聯(lián)合會(huì)診。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)于兩種方式聯(lián)合診斷，一項(xiàng)為陽(yáng)性則可判定為陽(yáng)性。對(duì)比不同分型患者TCT診斷結(jié)果，其中主要分析：意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamouscells of undP.termined significance，ASC-US)、未見(jiàn)上皮內(nèi)細(xì)胞病變(no intraepithelial cell lesions were found，NILM)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion， HSIL)。計(jì)算各種檢查方法單獨(dú)及聯(lián)合診斷宮頸惡性病變(癌前病變和浸潤(rùn)癌)的敏感度、特異度和符合率等指標(biāo)。敏感度(%)=真陽(yáng)性人數(shù)/(真陽(yáng)性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù))×100%；符合率(%)=符合例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各病理類型下TCT檢查結(jié)果 炎癥患者中5例出現(xiàn)ASC-US；CIN1中ASC-US 9例，LSIL 22例，HSIL 4例；CIN2、CIN3及浸潤(rùn)癌均未有NILM，浸潤(rùn)癌只有LSIL和HSIL，且HSIL占83.3%(表1)。

表1 宮頸組織病變篩查患者各病理分型下TCT診斷結(jié)果 (n；%)

2.2 各病理分型下HPV、hTERC基因表達(dá)、TCT及聯(lián)合檢查結(jié)果 hTERC基因的陽(yáng)性表達(dá)率隨細(xì)胞學(xué)分級(jí)的遞增(炎癥、CIN1、CIN2、CIN3、浸潤(rùn)癌)而增高，HPV和TCT陽(yáng)性率呈同樣趨勢(shì)(表2)。

表2 宮頸組織病理分型下HPV、hTERC基因表達(dá)、TCT及聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 (n；%)

2.3 診斷宮頸惡性病變的敏感度、特異度指標(biāo) HPV+TCT、HPV+hTERC進(jìn)行診斷時(shí)特異度和敏感度等指標(biāo)顯著高于單一一種方式診斷，單用一種檢測(cè)方法時(shí)，TCT的敏感度和特異度最高，聯(lián)合兩種檢測(cè)方法時(shí)，HPV+hTERCd的敏感度和特異度最高(表3)。

表3 宮頸惡性病變幾種診斷方式的敏感度和特異度比較 (%)

3 討 論

宮頸癌為婦科常見(jiàn)惡性腫瘤疾病，同時(shí)也為全球女性發(fā)病率僅低于乳腺癌的惡性腫瘤疾病，近年宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)，尤其是35歲之下女性，發(fā)病人數(shù)可占總發(fā)病的20%左右[5-7]?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為宮頸癌發(fā)生和發(fā)展為量變到質(zhì)變的過(guò)程，因此疾病早期治療逐步得到重視[8]。依據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)2002年宮頸癌患者5年內(nèi)生存率發(fā)達(dá)國(guó)家為61%，發(fā)展中國(guó)家則為41%，早期宮頸癌手術(shù)患者則可達(dá)到80%～90%[9]。宮頸癌患者癌前病變以及早期癌患者盡早篩查可有效預(yù)防、治療宮頸癌進(jìn)而可有效提升患者生存質(zhì)量[10，11]。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究已經(jīng)把HPV以及宮頸細(xì)胞涂片作為常規(guī)宮頸病變篩查的重要方式，陰性患者3年時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)CIN Ⅲ病變風(fēng)險(xiǎn)較高，現(xiàn)階段我國(guó)普遍使用HPV、TCT、hTERC基因不同篩查方式進(jìn)行診斷[12-14]。HPV作為常規(guī)宮頸病變篩查方式，常和宮頸細(xì)胞涂片聯(lián)合使用，診斷為陰性患者出現(xiàn)宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)極小，也為現(xiàn)階段我國(guó)常用的篩查方式。

現(xiàn)階段已有多數(shù)醫(yī)院將TCT作為宮頸癌篩查的重要方式，認(rèn)為此種疾病篩查方式有敏感度、特異度高的特點(diǎn)。細(xì)胞學(xué)檢查主要問(wèn)題在于僅進(jìn)行形態(tài)分析，所得細(xì)胞多為表層，深層獲取較為困難，因此TCT檢測(cè)時(shí)漏診率較高，且在閱片過(guò)程中多數(shù)情況需要醫(yī)務(wù)人員自主篩查。也有研究提出TCT異常和HPV感染之間雖然關(guān)系密切，但作為檢測(cè)手段自身存在假陽(yáng)率、假陰率過(guò)高的問(wèn)題[15]。

對(duì)宮頸癌分子遺傳學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮細(xì)胞突變?yōu)榘┘?xì)胞過(guò)程中需要特定基因組產(chǎn)生改變，其中主要為3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增。其中hTERC即為3號(hào)染色體長(zhǎng)臂參與腫瘤惡化的重要原因。有研究提出，3q26異常擴(kuò)增和浸潤(rùn)癌及HSIL之間有重要關(guān)系[16]。為有效提升宮頸癌前病變疾病診斷符合率，本研究也采用hTERC基因檢測(cè)方式，將其用于疾病篩查。本研究結(jié)果提示，hTERC檢測(cè)陽(yáng)性率可隨著患者細(xì)胞異常等級(jí)遞增而提升，其中hTERC基因表達(dá)檢測(cè)時(shí)：炎癥組陽(yáng)性7例、CIN1組陽(yáng)性10例、CIN2組陽(yáng)性26例、CIN3組陽(yáng)性22例、浸潤(rùn)癌陽(yáng)性9例，hTERC聯(lián)合HPV或HPV聯(lián)合TCT檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于單獨(dú)TCT及HPV。該研究結(jié)果也說(shuō)明hTERC基因異常擴(kuò)增患者宮頸上皮細(xì)胞惡性病變可能性較高，其中hTERC基因異?？勺鳛閷m頸癌前病變患者發(fā)展為浸潤(rùn)癌的重要指標(biāo)[17]。文獻(xiàn)[18]也表明，hTERC基因可極大降低細(xì)胞學(xué)假陽(yáng)性率，將其作為細(xì)胞學(xué)檢查重要補(bǔ)充手段。

多數(shù)研究認(rèn)為，端粒酶功能異常為染色體不穩(wěn)定的重要原因，主要處于染色體3q26區(qū)域hTERC基因編碼端粒酶RNA模板，可通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方式合成DNA至染色體末端，進(jìn)而維持端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定性，多數(shù)正常體細(xì)胞以及組織內(nèi)端粒酶均屬于陰性，當(dāng)端粒酶被激活之后，hTERC則會(huì)出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，維持端粒長(zhǎng)度，進(jìn)而使得細(xì)胞可獲得無(wú)限增殖能力，進(jìn)而引發(fā)腫瘤[19]。有研究證實(shí)，隨著宮頸癌患者疾病嚴(yán)重程度逐步增大，hTERC基因表達(dá)則會(huì)逐步提升，因此可認(rèn)定hTERC基因于宮頸癌發(fā)展過(guò)程中有重要作用，進(jìn)而為檢測(cè)hTERC基因篩查提供理論依據(jù)[20]。HR-HPV感染為宮頸癌主要原因，但較多患者感染時(shí)間短暫，一年左右可被免疫功能清除[21，22]。感染后從亞臨床至腫瘤需10年時(shí)間，當(dāng)患者處于潛伏期接受TCT檢測(cè)時(shí)便無(wú)法檢測(cè)到病變細(xì)胞，但依然可檢測(cè)到HPV。隨著HPV加劇，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)變化時(shí)，TCT檢測(cè)則會(huì)發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞，隨著HPV持續(xù)感染，則會(huì)引發(fā)宮頸癌前病變，此階段HPV特異度較低，假陽(yáng)性率較高[23]。TCT和HPV聯(lián)合篩查時(shí)，則可有效提升診斷特異度、敏感度，也可有效克服單一篩查時(shí)問(wèn)題。雖然癌前病變患者可攜帶HPV，但僅有少量患者會(huì)發(fā)展為宮頸癌[24]。TCT檢測(cè)時(shí)，輕度細(xì)胞學(xué)異常、非典型增生多出現(xiàn)于年輕女性，病變較輕患者檢出率較低，因此可知TCT和HPV均有自身問(wèn)題。

宮頸癌患者發(fā)病的基礎(chǔ)性病因?yàn)楦呶Ｐ虷PV持續(xù)感染，多數(shù)感染患者憑借自身免疫力可于8個(gè)月自然將HPV病毒清除，僅有少部分患者會(huì)持續(xù)感染HPV病毒，最終疾病也將發(fā)展為CINⅡ～Ⅲ，嚴(yán)重情況甚至發(fā)生宮頸浸潤(rùn)癌。本研究顯示：高危HPV感染所引發(fā)的疾病明顯多于HPV陰性患者，兩者之間有明顯差異，但單純使用HPV進(jìn)行檢測(cè)時(shí)敏感度則會(huì)受到影響。從本研究提示，HPV+hTERC聯(lián)合診斷時(shí)符合率、敏感度、特異度最高，證明兩種方式聯(lián)合診斷時(shí)對(duì)于宮頸癌患者不同疾病診斷階段均高于單一一種方式檢測(cè)。對(duì)于HPV+TCT診斷結(jié)果和HPV+hTERC聯(lián)合診斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用HPV+hTERC診斷時(shí)符合率更高，此種情況和hTERC診斷時(shí)優(yōu)勢(shì)更為顯著有關(guān)，同時(shí)也和兩種方式聯(lián)合診斷時(shí)更為互補(bǔ)有關(guān)，因此可知在疾病篩查時(shí)可推廣HPV+hTERC兩種方式聯(lián)合。

綜上所述，TCT、HPV、hTERC基因聯(lián)合診斷可有效判定宮頸組織病變狀況，進(jìn)而為疾病預(yù)防提供指導(dǎo)，其中HPV+hTERC聯(lián)合診斷時(shí)符合率、敏感度最高。