飼料中黃曲霉毒素檢測及其對牛奶品質(zhì)的影響

魏姜勉

（黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南駐馬店 463000）

牛奶營養(yǎng)成分豐富，包括豐富的蛋白質(zhì)、各類維生素和鈣質(zhì)等營養(yǎng)元素，在增強(qiáng)人體免疫力，治療人體動脈硬化、高血壓和骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要效用，為人體運動提供豐富的能量來源。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，以及人們的生活改善，牛奶出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，拓展了牛奶市場的發(fā)展空間（董順華，2020）。近年來，乳源性疾病在奶牛中不斷爆發(fā)，人們對牛奶質(zhì)量格外重視，因此，牛奶安全問題已成為人們最為關(guān)注的焦點。研究發(fā)現(xiàn)，少部分黃曲霉毒素在牛奶樣品中被檢測出來，而黃曲霉毒素是真菌代謝產(chǎn)生的二級代謝物，廣泛存在于飼料、谷物和食品中。近些年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)，動物飼料中的霉菌毒素污染情況與牛奶質(zhì)量息息相關(guān)。奶牛一旦攝入的飼料中含有少量黃曲霉毒素，會給奶牛帶來營養(yǎng)不良、免疫力下降等問題，給乳制品帶來安全隱患（關(guān)一凡等，2019；白陽等，2019；王倩，2019；孫瑞濤等，2019）。

黃曲霉毒素M1是奶牛飼料中攜帶的黃曲霉毒素B1被奶牛攝入體內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物，黃曲霉毒素M1主要存在于奶牛的乳、肝、腎臟和血液中。牛奶中存在部分黃曲霉毒素M1，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在乳制品生產(chǎn)和貯藏中含量不會發(fā)生明顯變化，不受消毒劑的影響（查滿千等，2019）。而牛奶和乳制品作為食品，對黃曲霉毒素的限量極為嚴(yán)格。目前，測定黃曲霉素毒素的方法有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法和放射免疫測定法，這些方法操作過程繁瑣、檢測周期長、靈敏度低，黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較難獲取，結(jié)果精確度低（王麗和劉文嬌，2018）。因此，本研究采用免疫親和柱-熒光光度計法測定動物體內(nèi)黃曲霉毒素M1含量，更好地測定飼料和動物體內(nèi)的黃曲霉毒素含量；本研究檢測奶牛常規(guī)飼料（青綠飼料、粗飼料、能量飼料、蛋白飼料）的黃曲霉毒素含量，以便分析奶牛飼料污染情況，以及其對牛奶品質(zhì)的影響程度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 牛奶樣品，青綠飼料，粗飼料，能量飼料，蛋白飼料。

1.2 實驗試劑 甲醇（純度高），氯化鈉（分析純），0.02%溴水儲備液，溴水使用液體，二水硫酸奎寧，硫酸溶液，黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，三氯甲烷，無水硫酸鈉。

1.3 實驗設(shè)備 熒光光度計，離心機(jī)，試管，燒杯，分液漏斗，濾紙，粉碎破碎儀，渦旋離心機(jī)，酶標(biāo)儀，電動振蕩儀器，普通和精密移液槍。

1.4 黃曲霉素M1檢測方法 黃曲霉素M1檢測采用免疫親和柱-熒光光度法。

1.4.1 牛奶樣品預(yù)處理 牛奶樣品加入一定量氯化鈉，用離心機(jī)離心牛奶樣品，對牛奶進(jìn)行脫脂處理，而后過濾。

1.4.2 免疫親和柱洗脫 將免疫親和柱連接玻璃注射器中，調(diào)節(jié)液體流速清洗柱子，對混合液進(jìn)行洗脫純化。

1.4.3 結(jié)果測定 在待測樣品中加入黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)上述操作獲得分離純化的洗脫液，再加0.002%溴溶液，將標(biāo)準(zhǔn)樣品放入熒光光度計中測定黃曲霉毒素M1溶液的熒光強(qiáng)度，且繪制黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，將待測溶液放入熒光光度計中黃曲霉毒素M1的熒光光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃曲霉毒素M1的含量。

1.5 飼料中黃曲霉素B1檢測方法

采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測定。

1.5.1 飼料樣品提取與加標(biāo) 將飼料樣品放入無菌燒杯中均勻混合，經(jīng)過濾后放入50 mL磨口試管中作為對照組提取液。將樣品提取液各自取4 mL放入試管中，再加入一定量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用渦旋機(jī)進(jìn)行渦旋，作為對照組的樣品提取液。

1.5.2 樣品測定 在酶標(biāo)板上加入50 μL的黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0、0.5、2、9、15 ng/ mL），其余各孔中加入50 ul樣品提取液，再分別加入50 μL酶標(biāo)抗原溶液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后，樣品中分別加入50 μL顯色劑，用酶標(biāo)儀（500nm）測定牛奶樣品各孔吸光度值。

1.6 計算方法

1.6.1 黃曲霉素M1計算方法 黃曲霉毒素M1計算公式如下：

A=CV/M

式中：A表示樣品中黃曲霉毒素M1含量，μg/kg；C表示樣品中黃曲霉毒素M1的濃度，ng/mL；V表示樣品的定容體積，mL；M表示樣品的質(zhì)量，g。

1.6.2 黃曲霉毒素B1的計算方法 建立線性方程來計算黃曲霉毒素B1的含量：用黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值A(chǔ)與標(biāo)準(zhǔn)溶液A0的比值為線性方程的縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，從而建立線性方程。待測樣品的吸光度值除以標(biāo)準(zhǔn)溶液A0的吸光度值，將其放入線性方程求出標(biāo)準(zhǔn)溶液的橫坐標(biāo)值，用對數(shù)計算公式來計算標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，與稀釋倍數(shù)相乘即可得到黃曲霉毒素B1的含量，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉毒素M1熒光光度計波長的測定 本研究使用熒光光度計檢測樣品中黃曲霉毒素M1的光譜信息，確定本實驗中黃曲霉毒素M1被激發(fā)，最佳的熒光光度計發(fā)射波長為550nm。

2.2 黃曲霉毒素M1的檢測方法精確度分析 本實驗根據(jù)實驗方法對黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行檢測，確定樣品實驗添加范圍為0.03 μg/L，這個數(shù)值范圍符合國際限量標(biāo)準(zhǔn)；牛奶樣品中添加黃曲霉毒素M1的安全量為0.05 μg/L，根據(jù)上述實驗開展10次重復(fù)實驗，實驗結(jié)果顯示，樣品中黃曲霉毒素M1的平均值為0.046 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.0045，該實驗結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1的檢測方法較為精確。

2.3 牛奶樣品的回收率測定 本研究是以陰性樣品為對照組，在不同陰性牛奶樣品中添加不同濃度的黃曲霉毒素M1，每組實驗為5個平行，分析不同濃度梯度對牛奶樣品回收率的影響，由表2可知，不同濃度的黃曲霉毒素（0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 μg/kg）添加到牛奶樣品中，不同添加水平牛奶樣品的黃曲霉毒素M1的平均含量分別為 0.23、0.53、0.80、1.03 和 1.40 μg/kg；牛 奶 樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.3 μg/kg時，牛奶樣品的平均回收率最小，為76.67%；牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為1.5 μg/kg時，牛奶樣品的平均回收率最大，為93.33%；隨著牛奶樣品中黃曲霉毒素M1添加量的增加，牛奶樣品中的變異系數(shù)先上升后下降，牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.9 μg/kg時，牛奶樣品的變異系數(shù)最大，為2.8%；牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.3 μg/kg時，牛奶樣品變異系數(shù)最低，為0.45%。

表2 添加不同水平的黃曲霉毒素M1對牛奶樣品回收率的影響

2.4 不同類型飼料原料樣品的黃曲霉毒素B1測定 本研究參照上述實驗方法，對不同類型飼料中黃曲霉毒素B1的含量進(jìn)行計算，結(jié)果如表3所示。由表3可知，青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料等樣品的陽性樣品中黃曲霉毒素B1的測定率為100%，在青綠飼料樣品中黃曲霉毒素B1的最大值是 12.34 μg/kg，最小值是 2.56 μg/kg；粗飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是11.68 μg/kg，最小值是1.24 μg/kg；能量飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是9.86 μg/kg，最小值是0.68 μg/kg；蛋白飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是9.36 μg/kg，最小值是 2.09 μg/kg。飼料污染程度參照黃曲霉毒素制定的國際標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示，而青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料陽性樣品中黃曲霉毒素B1的平均含量分別為11.45、4.25、5.24 和 7.58 μg/kg，小于 20 μg/kg，均屬于為輕度污染。

表1 黃曲霉毒素B1污染程度和標(biāo)準(zhǔn)

表3 不同類型飼料中黃曲霉毒素B1的測定

2.5 不同污染飼料飼喂奶牛后，牛奶樣品黃曲霉毒素M1的測定結(jié)果 由表4可知，被黃曲霉毒素B1污染的青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料飼喂奶牛后，牛奶樣品中黃曲霉毒素M1陽性測定率分別為98.7%、95.6%、94.6%和93.4%；青綠飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的最大含量是 0.167 μg/kg，最小含量是 0.005 μg/kg；粗飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的最大含量是0.187 μg/kg，最小含量是0.009 g/kg；能量飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1最大含量是0.197 μg/kg，最小含量是0.004 μg/kg；蛋白飼料牛奶樣品中黃曲霉毒素M1最大含量是0.201 μg/kg，最小含量是0.008 μg/kg。不同飼料中牛奶樣品的黃曲霉毒素M1的平均值分別為0.057、0.084、0.068和0.073 μg/kg。在本研究中，不同類型飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的測定率不同，青綠飼料牛奶樣品中陽性樣品測定率最高，結(jié)果表明，奶制品中的霉菌毒素污染源頭主要為青綠飼料。目前，我國衛(wèi)生部對乳制品的黃曲霉毒素M1含量限制為0.05 μg/kg，而本研究中牛奶樣品陽性最高值為 0.201 μg/kg，最低值為 0.004 μg/kg，平均值最大為0.084 μg/kg，嚴(yán)重超過我國衛(wèi)生部門制定的標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同類型飼料中牛奶的黃曲霉毒素M1的測定

3 討論

3.1 黃曲霉毒素M1測定方法的影響因素分析 本研究采用免疫親和柱-熒光光度法對不同類型飼料牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行測定。樣品中黃曲霉毒素M1屬于一種免疫抗原，可在動物體內(nèi)形成一定量的抗體，該抗體用于免疫親和柱中，便于吸附黃曲霉毒素M1。免疫反應(yīng)的抗體具有單一識別抗原能力強(qiáng)和靈敏度高等特性，免疫親和柱的單克隆抗體可有效吸附牛奶樣品黃曲霉毒素M1，用離心機(jī)離心和濾膜過濾后，將會提高樣品中黃曲霉毒素M1的純度，從而提高黃曲霉毒素M1測量的精準(zhǔn)度。免疫親和柱被應(yīng)用于食品中霉菌的分離和凈化，且柱內(nèi)單克隆抗體專一識別樣品中黃曲霉毒素M1，兩者進(jìn)行高度結(jié)合，避免其他外來物質(zhì)的干擾，可高度特異地識別外來牛奶樣品的霉菌毒素，具有溶劑使用量少，再生利用等特點（王新紅，2018）。

本研究采用熒光光度法檢測牛奶樣品中黃曲霉毒素M1含量，精準(zhǔn)含量為0.0001 μg/kg，且牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的添加水平為0.3～1.5 μg/kg，牛奶的回收率范圍76.67%～93.33%，變異系數(shù)為0.45%～2.8%，滿足我國制定的檢測標(biāo)準(zhǔn)。熒光光度法中樣品檢測速率極快，操作便捷、準(zhǔn)確、高效和安全，且儀器設(shè)備小，便于攜帶，度數(shù)穩(wěn)定，結(jié)果靈敏度高。熒光光度法一種高效檢測樣品霉菌毒素含量的方法，為樣品中霉菌毒素含量的檢測提供理論基礎(chǔ)。

3.2 飼料中黃曲霉毒素對牛奶品質(zhì)影響的分析 黃曲霉毒素是一類真菌代謝產(chǎn)生的毒素，對動物生長發(fā)育和肝臟產(chǎn)生重大損害（劉康和張佩華，2018）。畜禽類動物食用黃曲霉毒素污染的飼料后會引起動物中毒，給畜牧業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。董順華（2020）等研究發(fā)現(xiàn)，飼料中出現(xiàn)霉菌毒素污染會對奶牛器官、產(chǎn)奶量及牛奶安全和品質(zhì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。而黃曲霉毒素是動物飼料中的霉菌種類之一，但牛奶品質(zhì)也會受動物年齡、飼料含量及外部環(huán)境等因素影響。查滿千等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，奶牛投喂0.04 μg/kg的黃曲霉毒素會降低生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能，當(dāng)飼料沒有黃曲霉毒素時，奶牛生產(chǎn)性能較好，產(chǎn)奶量增加35%；劉康（2018）等研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加少量的黃曲霉毒素會降低奶牛的產(chǎn)奶性能。本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛攝入飼料中的黃曲霉毒素B1，經(jīng)體內(nèi)發(fā)生羥基化形成M1形式。

飼料是奶牛賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，為牛奶提供充足的營養(yǎng)，奶牛良好的生產(chǎn)性能取決于良好的飼料配方，牛奶品質(zhì)與奶牛產(chǎn)能息息相關(guān)。營養(yǎng)豐富的飼料是奶牛生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶的物質(zhì)基礎(chǔ)（白陽等，2019；孫瑞濤等，2019）。建立高效安全的飼料產(chǎn)業(yè)是安全牛奶的重要保障。奶牛飼料在加工過程中要及時處理污染飼料，加強(qiáng)對飼料質(zhì)量的監(jiān)督和管理；飼料利用生物脫毒方法，安全高效地去掉飼料中的霉菌毒素；及時管理飼料霉變，及時處理霉變飼料；在飼料投喂環(huán)節(jié)，及時處理殘存飼料，降低飼料污染率，提高奶牛飼料的安全性，發(fā)展健康、安全、優(yōu)質(zhì)的飼料，進(jìn)而提高牛奶質(zhì)量（王倩，2019）。

本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中黃曲霉毒素B1屬于輕度污染，而牛奶中黃曲霉毒素M1嚴(yán)重超過國家衛(wèi)生部門制定的標(biāo)準(zhǔn)。霉菌污染是影響畜牧飼料業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素，也會對牛奶品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。奶牛飼養(yǎng)過程中，黃曲霉毒素對奶產(chǎn)品的影響程度較大，面對奶產(chǎn)品的需求量不斷擴(kuò)大，因此，應(yīng)加強(qiáng)飼料管理，及時檢測飼料污染物情況和預(yù)防霉菌污染，減少飼料中黃曲霉毒素的含量，保障奶牛健康和牛奶品質(zhì)。

4 結(jié)論

黃曲霉毒素是飼料中常見的污染毒素之一，嚴(yán)重影響奶牛的健康和牛奶品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，可采用免疫親和柱-熒光光度法檢測黃曲霉毒素M1含量，該方法簡單、高效、安全和靈敏度高，檢測速度快，滿足牛奶樣品的檢測需求。本研究對奶牛飼料中青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料中的黃曲霉毒素B1及牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)飼料樣品屬于輕度污染，而牛奶樣品嚴(yán)重超過國家相關(guān)部門制定的標(biāo)準(zhǔn)，污染程度較大；飼料中黃曲霉毒素B1經(jīng)奶牛攝食后形成牛奶中的黃曲霉毒素M1。為了保證人體健康，飼料生產(chǎn)過程中應(yīng)注意控制霉菌毒素的產(chǎn)生，加強(qiáng)飼料的安全品質(zhì)管理，提高牛奶質(zhì)量。