熱休克蛋白70及功能成像參數(shù)與早期小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系

張東偉，藍(lán) 冰，鐘家將，楊朝生，劉瓊霞

(廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 柳州 545000)

肺癌已成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)占所有肺癌的10%～20%。SCLC具有生長(zhǎng)速度快，早期易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差的一類特殊癌癥，SCLC對(duì)初期化療、放療較為敏感[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，早期SCLC患者采用手術(shù)治療較非手術(shù)治療獲益更多且TNM分期在Ⅰ～Ⅱ期的SCLC患者5年內(nèi)生存率優(yōu)于非手術(shù)治療[2-3]。需要指出的是，早期SCLC治療效果及預(yù)后生存預(yù)測(cè)的腫瘤標(biāo)志物有待深入研究。當(dāng)前關(guān)于SCLC的腫瘤標(biāo)志物指南推薦的主要是胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide，Pro-GRP)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)，這兩種標(biāo)志物對(duì)SCLC及其預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值[4]，但仍存在一定的假陽性率，且該指標(biāo)特異性較差。Hsp70作為熱休克蛋白家族一員[5]，在多種類型惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，但是否與早期SCLC預(yù)后有關(guān)是值得研究的。功能成像已經(jīng)用于腫瘤的診斷，其對(duì)于早期腫瘤的診斷敏感度相對(duì)較高。正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission on tomography，PET)能夠顯示機(jī)體病灶組織細(xì)胞代謝、增殖情況，是敏感度非常高且評(píng)價(jià)腫瘤生物學(xué)特性較為先進(jìn)的分子影像技術(shù)[6]。18F脫氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG)PET相關(guān)代謝參數(shù)，如MTV、iSUV、SUVmean、SUVmax等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但是目前尚缺少研究報(bào)道Hsp70及功能成像參數(shù)與癌證之間的關(guān)系。本研究旨在分析18F-FDG PET/CT相關(guān)功能參數(shù)及Hsp70與早期LD-SCLC的預(yù)后關(guān)系，為有效提高SCLC患者預(yù)后生存率提供技術(shù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2010年3月—2014年10月在我院接受治療的早期局限性小細(xì)胞肺癌(limited-disease small cell lung cancer，LD-SCLC)患者(LD-SCLC組)的臨床及隨至2019年10月30日有關(guān)資料。入選標(biāo)準(zhǔn)為：①符合第八版肺癌TNM分期指南中有關(guān)LD-SCLC有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②具有完整的病史資料及隨訪記錄；③術(shù)后病理組織明確診斷結(jié)果；通過增強(qiáng)CT、顱腦MRI、鎖骨上與頸部淋巴結(jié)超聲及骨掃描等證實(shí)排除其他部位腫瘤；④根據(jù)“第八版肺癌TNM分期指南”進(jìn)行分類，其中Ⅰ～Ⅱ期患者納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①ED-SCLC患者；②術(shù)前放化療或者其他治療手段者；③無法確定手術(shù)或放化療狀態(tài)；④根據(jù)“第八版肺癌TNM分期指南”，無法確定TNM分期者或者TNM分期在Ⅲ期及以上者；⑤臨床資料不完整或伴有其他惡性腫瘤者；⑥存在嚴(yán)重或者不能控制的基礎(chǔ)性疾病，如嚴(yán)重的糖尿病、不穩(wěn)定型心絞痛、肝腎功能不全者。納入符合標(biāo)準(zhǔn)的LD-SCLC患者57例，男性36例，女性21例，年齡59～79歲，平均(66.59±11.24)歲，根據(jù)TNM分期分為Ⅰ期32例，Ⅱ期25例。另選取同期來我院經(jīng)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常的健康人員57例作為對(duì)照(NC組)，男性31例，女性26例，年齡58～78歲，平均(66.54±10.33)歲，2組性別、年齡、吸煙指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2手術(shù)方法 57例LD-SCLC患者均經(jīng)手術(shù)+放化療進(jìn)行治療。其中，手術(shù)方式依據(jù)術(shù)前評(píng)估及術(shù)中觀察行一側(cè)全肺葉切除術(shù)或部分肺葉切除術(shù)(包括支氣管袖狀肺葉切除術(shù))，同時(shí)行肺門、縱膈淋巴結(jié)清掃術(shù)；化療方式則根據(jù)手術(shù)情況以及患者自身耐受情況進(jìn)行治療，化療3周。25例患者采用EP化療方案：第1～3天順鉑30 mg/m2，第1～5天足葉乙甙100 mg/m2；32例患者采用CE化療方案：第1天卡鉑AUC 5.0～6.0，第1～5天足葉乙甙100 mg/m2?；煼桨感枰鶕?jù)患者情況進(jìn)行調(diào)整。40例患者待化療治療首次不良反應(yīng)緩解后采用放療進(jìn)行預(yù)防性頭顱放射，1.5 Gy，1次/d的常規(guī)分割放療，總劑量不超過30 Gy，剩余17例患者因體力狀況評(píng)分(performance status，PS)在2分以上或者患者因年齡原因不適合接受放療。

1.3臨床資料收集及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè) 臨床收集的資料有年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫瘤直徑、TNM分期等。治療前抽取所有研究對(duì)象肘靜脈血，離心后獲得血清。檢測(cè)的指標(biāo)有血清胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide，Pro-GRP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)。采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)Pro-GRP、NSE，酶法檢測(cè)LDH，ELISA法檢測(cè)Hsp70。

1.418F-FDG PET/CT掃描分析 采用Discovery LS型PET/CT(美國GE公司)進(jìn)行掃描?；颊咴趻呙枨靶枰持辽? h以及控制血糖在6.59 mmol/L以下，開啟靜脈通道，設(shè)置留置針。將18F-FDG(300-400MBq)通過靜脈通道迅速注入，而后飲下500 mL水從而促進(jìn)18F-FDG代謝。準(zhǔn)確記錄每次注射放射性核素體積、注射時(shí)間以及注射前核素活度等。研究對(duì)象在休息60 min后取平臥位，開始掃描全身，CT圖像參數(shù)為90 mA，120 kV，層厚4.25 mm，球管轉(zhuǎn)速0.8 s/旋轉(zhuǎn)，PFOV 50 cm，再掃描頭部，基本參數(shù)一致。平均4～5個(gè)床位，每個(gè)床位5 min。18F-FDG PET/CT參數(shù)：主要由兩個(gè)臨床經(jīng)驗(yàn)非常豐富核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師分析，勾畫大體腫瘤體積(gross tumor volume，GTV)，勾畫過程中需要在CT圖像下將腫瘤組織及周圍軟組織全部勾畫在內(nèi)。代謝體積(metabolic tumor volume，MTV)經(jīng)18F-FDG濃聚灶后，在放射性攝取顯示最清晰的層面沿著病灶周邊勾勒感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，以顯像區(qū)域作為代謝活性區(qū)域，逐層勾畫其邊界，將每層面積乘以層厚得到體積，每層體積相加后得到MTV；計(jì)算機(jī)可以自動(dòng)測(cè)量MTV內(nèi)的最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(maximal standardized uptake values，SUVmax)、平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(the average standardized uptake values，SUVmean)；計(jì)算整合標(biāo)準(zhǔn)攝取值(intergered SUV，iSUV)=所有惡性病灶SUVmean平均值×MTV。

1.5生存率分析 所有LD-SCLC患者均接受隨訪，隨訪時(shí)間從治療后第1天開始至隨訪截止時(shí)間(2019年10月30日)或患者死亡、失訪等。隨訪的方式有患者來源復(fù)查、電話咨詢等，以網(wǎng)絡(luò)、函件隨訪為輔。至隨訪時(shí)間截止，共有4例患者失訪。研究患者總生存率(overall survival，OS)、肺癌特異性生存率(lung cancer specific survival，LCSS)及疾病無進(jìn)展生存率(disease free survival，DFS)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、Mann-Whitney 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析Hsp70與NSE、Pro-GRP的相關(guān)性，ROC曲線分析Hsp70對(duì)LD-SCLC診斷價(jià)值。采用Kalplan-Meier法分析患者治療后生存情況，Log rank對(duì)各組的生成率進(jìn)行比較，多因素Cox回歸模型分析影響生存的相關(guān)變量。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NC組與LD-SCLC組臨床資料及相關(guān)生化指標(biāo)比較 LD-SCLC組Pro-GRP、NSE、LDH、Hsp70、MTV、SUVmax、SUVmean、iSUV均高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表2，圖1。

表2 NC組與LD-SCLC組臨床資料及相關(guān)生化指標(biāo)比較

圖1 NC組與早期LD-SCLC組Hsp70表達(dá)差異

2.2Hsp70、MTV、iSUV對(duì)早期LD-SCLC診斷價(jià)值的比較 以是否為早期LD-SCLC為自變量，繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，Hsp70診斷早期LD-SCLC的敏感度、特異度為76.04%、88.00%，AUC：0.744(95%CI：0.689～0.863)，當(dāng)Youden指數(shù)最大時(shí)，Hsp70診斷早期LD-SCLC的最佳臨界值為3.24 μg/L；MTV診斷早期LD-SCLC的敏感度、特異度為80.34%、84.23%，AUC：0.792(95%CI：0.706～0.897)，當(dāng)Youden指數(shù)最大時(shí)，MTV診斷早期LD-SCLC的最佳臨界值為64.63 cm3；iSUV診斷早期LD-SCLC的敏感度、特異度為82.90%、87.63%，AUC：0.805(95%CI：0.739～0.917)，當(dāng)Youden指數(shù)最大時(shí)，iSUV診斷早期LD-SCLC的最佳臨界值為316.78，見圖2。

圖2 Hsp70、MTV及iSUV診斷早期LD-SCLC的ROC曲線

2.3Hsp70表達(dá)與患者臨床特征因素及功能成像參數(shù)之間的關(guān)系 以Hsp70臨界值3.24 μg/L進(jìn)行分組，以Hsp70≥3.24 μg/L為高表達(dá)組、Hsp70<3.24 μg/L為低表達(dá)組，分析Hsp70與臨床特征因素及近期療效之間關(guān)系。結(jié)果顯示，Hsp70≥3.24 μg/L亞組臨床分期、MTV及iSUV方面，與Hsp70<3.24 μg/L差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 Hsp70表達(dá)與患者臨床特征因素及近期療效之間的關(guān)系

2.4Hsp70與患者預(yù)后生存的關(guān)系 57例患者失訪4例，剩余53例患者在1年、3年、5年OS分別為89.62%、39.51%、27.07%；肺癌特異性生存率(lung cancer specific survival，LCSS)分別為92.35%、49.56%、30.43%；疾病無進(jìn)展期生存率(disease progression-free survival rate，DFS)分別為80.87%、39.18%、20.87%。進(jìn)一步對(duì)Hsp70、MTV、iSUV分組，Kalplan-Meier法分析Hsp70、MTV、iSUV不同亞組5年內(nèi)OS、LCSS及DFS。結(jié)果顯示，Hsp70<3.24 μg/L亞組5年內(nèi) LCSS(59.52%)、DFS(33.33%)，與Hsp70≥3.24 μg/L亞組比較(LCSS：35.46%，DFS：21.27%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log rankχ2=5.476、4.807，P=0.017、0.028)；MTV<64.63 cm3亞組5年內(nèi) OS(49.82%)、DFS(34.84%)，與MTV≥64.63 cm3亞組比較(OS：23.48%，DFS：20.65%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log rankχ2=4.889、5.812，P=0.028、0.023)；iSUV<316.78 kg/L亞組5年內(nèi) OS(50.11%)、LCSS(35.74%)，與iSUV≥316.78 kg/L亞組比較(OS：24.09%，LCSS：20.42%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log rankχ2=6.116、6.893，P=0.015、0.013)，見圖3。

圖3 Kalplan-Meier法分析Hsp70對(duì)早期LD-SCLC的OS、LCSS、DFS情況比較

2.5Cox模型多因素分析 以預(yù)后的結(jié)果為因變量(死亡=0，生存=1)；以性別(男性=0，女性=1)，年齡(<65歲=0，≥65歲=1)，吸煙指數(shù)(<400支/年=0，≥400支/年=1)，臨床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1)，化療方案(EP=0，CE=1)，預(yù)防性腦放療(是=0，否=1)，NSE(<75.9 μg/L=0，≥75.9 μg/L=1)，ProGRP(<121 ng/L=0，≥121 ng/L=1)，Hsp70(<3.24 μg/L=0，≥3.24 μg/L=1)，MTV(<64.63 cm3=0，≥64.63 cm3=1)，iSUV(<316.78 kg/L=0，≥316.78 kg/L=1)為自變量。采用Cox模型回歸分析顯示，臨床分期、預(yù)防性腦放療、NSE、ProGRP、Hsp70、MTV及iSUV為早期LD-SCLC預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 Cox模型分析早期LD-SCLC預(yù)后的影響因素

3 討 論

SCLC主要來源于內(nèi)分泌細(xì)胞，其惡性程度高、生長(zhǎng)速度快，易導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且預(yù)后差等特點(diǎn)的一類特殊類型的肺癌，其5年的生存率在5%左右。目前普遍認(rèn)為SCLC主要采用化療為主，輔以局部放療。但近年來，對(duì)于早期局限性SCLC患者經(jīng)手術(shù)治療較非手術(shù)治療具有更高預(yù)后生存率。1973年至2007年間，SCLC的分期標(biāo)準(zhǔn)主要是采用美國退伍軍人肺癌協(xié)會(huì)的分期系統(tǒng)，分為局限期(limited diaease，LD)與廣泛期(extensive disease，ED)[7]，但該方法極不適用于手術(shù)治療。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，將SCLC患者按照TNM分期進(jìn)行手術(shù)治療，結(jié)果顯示，TNM分期用于可切除的SCLC時(shí)，TNM分期較LD/ED分期更為適用[8-10]。目前，對(duì)于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的LD-SCLC患者采用手術(shù)治療后患者生存率顯著高于非手術(shù)治療，而對(duì)于Ⅲ期患者手術(shù)+化療治療患者生存率并不優(yōu)于化療治療。因此，本研究納入TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的LD-SCLC患者，采用手術(shù)+化療進(jìn)行治療，目前對(duì)于預(yù)防性腦放射治療雖然NCCN指南中不作為Ⅰ類推薦，但是仍然是手術(shù)治療后推薦治療的方式。本研究顯示發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性腦放療為患者5年內(nèi)生存率的影響因素，說明預(yù)防性腦放療對(duì)于預(yù)防癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移有著一定的作用，需要指出的是如何進(jìn)一步提高針對(duì)年齡偏大、PS評(píng)分差的患者治療手段是值得臨床進(jìn)一步研究和思考的。

熱休克蛋白是一類在結(jié)構(gòu)上高度保守且功能非常廣泛的蛋白，在哺乳類動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp27、Hsp40、Hsp70、Hsp90及Hsp110等，熱休克蛋白在細(xì)胞中主要發(fā)揮分子伴侶的功能，具有協(xié)助新合成蛋白質(zhì)正確解聚、轉(zhuǎn)運(yùn)以及結(jié)合其他蛋白質(zhì)[11]。研究表明，熱休克蛋白在多種惡性腫瘤組織或者細(xì)胞中存在不同程度的表達(dá)，Hsp70作為誘導(dǎo)表達(dá)最高的一種熱休克蛋白，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70對(duì)多種類型惡性腫瘤的診斷及預(yù)后生存具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，Hsp70高表達(dá)對(duì)化療、放療治療預(yù)后差有一定的預(yù)示作用[13]。近年來，Hsp70在肺癌中的發(fā)生發(fā)展、耐藥性以及預(yù)后等均具有一定的作用。需要指出的是，Hsp70對(duì)于早期SCLC的診斷、預(yù)后生存等是否存在一定的預(yù)測(cè)價(jià)值是值得研究的。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)早期LD-SCLC患者與肺部良性疾病患者Hsp70存在顯著表達(dá)差異，且Hsp70對(duì)早期LD-SCLC具有較高的診斷價(jià)值，進(jìn)一步隨訪分析顯示，Hsp70為早期LD-SCLC患者治療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。值得提出的是，以Hsp70臨界點(diǎn)3.24 μg/L進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，當(dāng)Hsp70高于3.24 μg/L時(shí)，患者預(yù)后差。

對(duì)于病變?cè)诜伍T的SCLC患者影像學(xué)檢查存在一定的困難，而尋找敏感度高、特異度強(qiáng)的血清腫瘤生物學(xué)指標(biāo)有助于提高臨床的診斷、治療價(jià)值[14]。目前，胃泌素釋放前體(Pro-Gastrin-Releasing Peptide，ProGRP)和神經(jīng)元烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是指南推薦用于SCLC診斷的腫瘤標(biāo)志物。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NSE、ProGRP診斷SCLC的敏感度分別在54.5%～61.0%、62.05%～80.0%，而特異度分別在60.0%～80.0%、85.0%～97.0%[15]。目前，已有部分研究證實(shí)NSE、ProGRP對(duì)SCLC預(yù)后的診斷價(jià)值，但仍然存在一定的假陽性和假陰性率。本研究采用Hsp70診斷早期SCLC，結(jié)果顯示其診斷也有一定的診斷效能。采用相關(guān)性分析顯示，Hsp70與NSE、ProGRP存在顯著正相關(guān)，這也為Hsp70診斷早期SCLC提供了可靠依據(jù)。

需要提出的是，目前對(duì)于早期LD-SCLC經(jīng)手術(shù)+化療后的預(yù)后預(yù)測(cè)研究報(bào)道相對(duì)較少，其主要有以下幾個(gè)方面的原因：①手術(shù)+化療治療早期LD-SCLC尚未完全得到指南推薦；②尚未完全證實(shí)手術(shù)治療較非手術(shù)獲得更長(zhǎng)的生存；③對(duì)于Ⅱ期SCLC患者，手術(shù)并不占優(yōu)勢(shì)，可能鑒于以上原因，目前對(duì)于手術(shù)+化療治療早期LD-SCLC預(yù)后的研究報(bào)道相對(duì)較少。盡管如此，手術(shù)+化療治療早期LD-SCLC患者獲益以及預(yù)后生存更為明顯。為進(jìn)一步做好對(duì)早期LD-SCLC經(jīng)手術(shù)+化療的預(yù)后生存分析，我們采用Hsp70診斷早期LD-SCLC的臨界值3.24 μg/L進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，Hsp70在3.24 μg/L以上患者預(yù)后生存差，采用Cox模型回歸分析顯示，Hsp70為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。需要指出的是，NSE、ProGRP對(duì)早期LD-SCLC的治療后的預(yù)測(cè)作報(bào)道較少，本研究也未進(jìn)一步開展NSE、ProGRP對(duì)早期LD-SCLC預(yù)后生存的預(yù)測(cè)作用。筆者認(rèn)為，后續(xù)可以進(jìn)一步分析NSE、ProGRP及Hsp70對(duì)早期LD-SCLC預(yù)后生存預(yù)測(cè)的價(jià)值比較，進(jìn)一步確定早期LD-SCLC診斷的腫瘤特異性標(biāo)志物，也為臨床診斷、治療提供參考依據(jù)。

18F-FDG能夠很好的反映機(jī)體腫瘤葡萄糖代謝過程，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)攝取值能夠很好反映體內(nèi)腫瘤情況[16]；另有研究顯示，MTV及iSUV與胰頭癌、宮頸癌、乳腺癌等疾病密切相關(guān)[17-19]。SCLC尚無明確的療效及預(yù)后因子，通過功能影響可能有助于對(duì)早期LD-SCLC患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。需要指出的是，MTV、iSUV與早期SCLC之間的關(guān)系尚缺少更多證據(jù)。通過本研究顯示，正常對(duì)照組MTV、iSUV與早期SCLC患者存在明顯差異，通過預(yù)后分析也顯示該指標(biāo)為早期SCLC治療后的影響因素，進(jìn)一步說明iSUV及MTV為早期SCLC的預(yù)后影響因素。

綜上所述，MTV、iSUV及Hsp70與早期LD-SCLC早期手術(shù)+放化療治療的預(yù)后相關(guān)，建議臨床進(jìn)一步加大樣本量的研究。