一例由疫苗接種引起的商品肉雞多病原混合感染

盛曉丹 郭卉 秦春芝 劉霞 黃迪海 徐懷英 秦桌明

摘 要：為確診山東某商品肉雞群發(fā)病的原因，采集病死雞的喉頭、氣管等組織，分別進(jìn)行核酸和病原分離鑒定。結(jié)果顯示，傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）和禽腺病毒4型（FAdV-4）等特異性PCR均呈陽(yáng)性，而新城疫病毒（NDV）、低致病性禽流感H9N2等均為陰性。測(cè)序結(jié)果表明，ILTV分離株（PY）與疫苗株（K317）ICP4基因的核苷酸同源性為100%;而IBV分離株（PY）與疫苗株H120、4/91N基因的同源性分別為86.4%、86.6%，顯示出較大的差異。CAM途徑接種雞胚分離出腺病毒，且對(duì)SPF雞胚具有一定的致病性。同時(shí)，從病雞肝臟中分離到大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)證實(shí)對(duì)多粘菌素B、健牧茶多酚、阿莫西林棒酸、頭孢噻肟敏感，采用敏感藥物治療后取得一定的臨床治療效果。綜上所述，該病是一起由疫苗接種應(yīng)激而引起的多病原混合感染。

關(guān)鍵詞：傳染性喉氣管炎病毒;禽腺病毒4型;傳染性支氣管炎病毒;大腸桿菌;混合感染

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2021）11-0039-06

2021年4月于山東某商品肉雞場(chǎng)發(fā)現(xiàn)一起嚴(yán)重呼吸道癥狀的病例。該場(chǎng)肉雞于7日齡免疫新支二聯(lián)活疫苗（La Sota株+H120株），19日齡采用點(diǎn)眼方式接種傳染性喉氣管炎活疫苗（K317株），免疫2 d后出現(xiàn)呼嚕聲、咳嗽，嚴(yán)重者有引頸呼吸等呼吸困難的癥狀，并迅速波及全群，死淘率逐日攀升，多種藥物治療效果不佳。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)喉頭、氣管粘膜出血嚴(yán)重，氣管內(nèi)有大量的紅色粘液，細(xì)支氣管內(nèi)有黃色栓塞物，個(gè)別雞出現(xiàn)心包炎、氣囊炎、心包積液增多的癥狀，疑似病毒和細(xì)菌混合感染。筆者采集死亡雞只的氣管、肺、喉頭、肝臟等組織樣品進(jìn)行病毒的PCR鑒定及細(xì)菌分離與藥敏試驗(yàn)，確認(rèn)肉雞發(fā)病及死亡原因，為此次病情的預(yù)防控制和科學(xué)用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器

Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技有限公司;DNA回收試劑盒，購(gòu)自天根生物科技有限公司;Reverse Transcriptase M-MLV、TaKaRa Taq HS Perfect Mix、DL2000 bp DNA Marker，購(gòu)自寶生物（北京）有限公司;藥敏片，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;健牧茶多酚藥敏紙片，自制（200 μg/片）;10日齡SPF雞胚，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供;PCR儀（TC-XP型），購(gòu)自杭州博日科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中FAdV-4、ILTV、IBV、新城疫（NDV）和H9亞型AIV的經(jīng)典序列，應(yīng)用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物，由北京六合華大基因有限公司合成。病毒檢測(cè)引物見(jiàn)表1。

1.3 病料處理

剖檢具有典型癥狀的發(fā)病雞或死亡雞，取其氣管或刮取粘液、肺、脾臟作為病料，剪碎、勻漿，反復(fù)凍融3次后，1 2000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒖梢刹×厦麨镻Y。

1.4 病毒核酸提取

按照Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取上清液中的RNA和DNA。

1.5 IBV、AIV H9、NDV反轉(zhuǎn)錄

取經(jīng)DNaseⅠ處理過(guò)的1 μg總RNA為模板，加Random Primer（0.5 μg/μL）1 μL，按照Reverse Transcriptase M-MLV試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA作為PCR反應(yīng)模板。

1.6 病毒核酸PCR鑒定

以cDNA和提取的總DNA為模板，采用表1的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 9. 5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果，回收目的條帶進(jìn)行測(cè)序。利用Lasergen 7.1和MEGA 5軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較與進(jìn)化樹(shù)分析。

1.7 病毒分離

取1.3中制備的病料上清，利用0.22 μm過(guò)濾器除菌，分別接種10日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜（CAM）和尿囊腔，棄24 h內(nèi)非特異性死亡的雞胚，37 ℃培養(yǎng)96 h，分別無(wú)菌收集尿囊液和CAM，盲傳3代，觀察雞胚病變，提取CAM的DNA樣本和尿囊液的RNA樣本進(jìn)行核酸檢測(cè)。

1.8 細(xì)菌分離與藥敏試驗(yàn)

1.8.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌操作采集肝臟組織樣品，劃線接種血液瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取灰白色菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取粉紅色菌落，進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.8.2 16S rDNA分子鑒定 取新鮮制備的分離純化菌液適量，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA通用引物為特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5μL、通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各0.5 μL、DNA 1 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，于4℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與參考菌株進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)。

1.8.3 藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-bauer瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行常用抗生素的敏感性試驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈直徑，并參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（ 2013年）的標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒核酸檢測(cè)

對(duì)病雞的氣管粘液檢測(cè)顯示，F(xiàn)AdV-4分離株（PY）的片段長(zhǎng)度為885 bp;ILTV分離株（PY）的 ICP4基因片段為574 bp;IBV分離株（PY）的N基因片段長(zhǎng)度為830 bp;以上均與FAdV、ILTV和IBV的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照片段大小相符。但對(duì)NDV和H9N2亞型禽流感病毒的核酸檢測(cè)陰性（圖1）。

2.2 ILTV和IBV序列同源性分析

利用MegAlign生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列同源性比較。結(jié)果顯示，ILTV PY分離株與疫苗株K317株（GenBank 登錄號(hào)：JX458824）ICP4基因序列的核苷酸同源性為100%，推測(cè)ILTV PY可能為疫苗株;IBV PY分離株（PY01.2021）與中國(guó)IBV近期流行株QX株的N基因核苷酸同源性高達(dá)93.4%，顯示出較高的同源性，而與國(guó)內(nèi)常用的疫苗株H120和4/91同源性?xún)H為86.4%、86.6%，顯示出較大的遺傳距離（圖2、圖3）。

2.3 病原分離

病料上清無(wú)菌處理后，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，120 h內(nèi)未出現(xiàn)雞胚死亡，且盲傳3代仍未發(fā)現(xiàn)雞胚死亡。解剖第3代感染雞胚和未感染雞胚發(fā)現(xiàn)：感染雞胚發(fā)育不良，注射部位雞胚CAM增厚，形成邊緣凸起、中間凹陷的灰白色痘斑，而對(duì)照組雞胚發(fā)育正常。收集第3代CAM，提取病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示ILTV和FAdV-4均為核酸陽(yáng)性，與病料檢測(cè)結(jié)果一致。表明ILTV和FAdV-4感染SPF雞胚能導(dǎo)致雞胚發(fā)育異常，但對(duì)雞胚不致死。

病料上清無(wú)菌處理后經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，連續(xù)三代感染120 h內(nèi)未出現(xiàn)雞胚死亡，但感染雞胚發(fā)育不良。收集第3代感染36 h的雞胚尿囊液，提取病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示IBV為陽(yáng)性，與病料檢測(cè)結(jié)果一致。

2.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

分離株在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、光滑的粉紅色菌落，經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察到兩端鈍圓的紅色短桿菌，為革蘭氏陰性菌，疑為大腸桿菌。

分離株16S rRNA擴(kuò)增條帶大小為1 500 bp左右。該片段測(cè)序后與Genbank已有序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分離菌株與大腸桿菌Escherichia coli strain AH01（CP055251） 的16S rRNA核苷酸同源性較高，為98%，因此鑒定該分離菌為大腸桿菌。

2.5 分離菌耐藥性檢測(cè)

由表2可見(jiàn)，分離菌僅對(duì)多粘菌素B、頭孢曲松、頭孢噻肟、健牧茶多酚敏感，對(duì)阿莫西林棒酸中度敏感，對(duì)氨芐西林、阿奇霉素、多西環(huán)素、林可霉素、氟苯尼考、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)等多數(shù)藥物耐藥。

3 討論

本試驗(yàn)先后從山東某商品肉雞場(chǎng)的病死雞氣管中檢測(cè)到ILTV、FAdV-4和IBV，經(jīng)測(cè)序后確診為ILTV、FAdV-4和IBV。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，ILTV片段核酸測(cè)序結(jié)果與疫苗免疫所用的疫苗株K317的ICP4基因核苷酸同源性為100%，結(jié)合該雞場(chǎng)近期曾經(jīng)免疫過(guò)ILTV弱毒疫苗，因此推斷此次疫情是一起由不合理的疫苗使用而引起的多病原混合感染和繼發(fā)感染。應(yīng)引起養(yǎng)殖企業(yè)的高度重視。建議養(yǎng)殖企業(yè)，在ILTV疫苗免疫前需對(duì)需要免疫的雞群進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)做好其他病原的綜合防控工作，防止繼發(fā)感染 [1]。

免疫接種是目前預(yù)防傳染性喉炎最有效的途徑。ILTV疫苗主要包括雞胚源疫苗（CEO）、細(xì)胞源疫苗（TCO）和基因工程疫苗等三大類(lèi)型。其中，CEO疫苗最為常用，占我國(guó)成年雞ILTV活疫苗使用量的70%以上。其優(yōu)點(diǎn)是：使用方便，適合于滴眼、飲水或噴霧等多種途徑免疫，每種方法均能夠提供較好的群體免疫效果。缺點(diǎn)是：對(duì)1月齡以?xún)?nèi)的雛雞具有致病性，僅適用于4周齡以上的育成雞或成年雞[2]，對(duì)雛雞存在一定的安全隱患。此次疫病發(fā)生就是一個(gè)例證。相反，基因工程疫苗在商品肉雞免疫方面則具有較大潛力。王云峰等（2001）利用FPV為載體，成功表達(dá)ILTV中國(guó)王崗株gB基因，通過(guò)對(duì)1日齡雞接種試驗(yàn)表明，該重組病毒無(wú)論對(duì)商品雞還是SPF雞的免疫保護(hù)均為100%，該疫苗已于2005年獲得國(guó)家新獸藥注冊(cè)證書(shū)[3-5]。在美國(guó)，有兩個(gè)已批準(zhǔn)的商業(yè)重組ILTV疫苗：一是由CEVA生產(chǎn)（Biomune公司），該疫苗利用FPV作為載體插入ILTV的gB和UL32基因;二是由Intervet公司生產(chǎn)，是將ILTV的gI和gD基因克隆到火雞皰疹病毒基因中。上述疫苗均適合于胚胎接種或1日齡雛雞接種?？傊?，對(duì)于已發(fā)生過(guò)或周邊發(fā)生過(guò)疫情的規(guī)?；怆u場(chǎng)，建議可接種1日齡雛雞，能有效預(yù)防ILT的發(fā)生而減少危害[6]。因ILTV是DNA病毒，在環(huán)境中的存活能力較強(qiáng)，應(yīng)延長(zhǎng)雞舍空欄期的時(shí)間，并采取醛類(lèi)、含氯消毒劑等進(jìn)行交叉反復(fù)消毒[7]。

本試驗(yàn)從氣管中檢測(cè)到的IBV分離株，與IBV流行株 QX株，其N(xiāo)基因部分序列同源性較高，而與該養(yǎng)殖場(chǎng)近期免疫的H120株和4/91株同源性?xún)H為85.7%和87.2%，因此推斷該IBV分離株可能為野毒株，而非疫苗株。QX型IBV目前仍是山東地區(qū)流行的主要毒株，但多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)免疫H120、4/91株，對(duì)QX型強(qiáng)毒株感染的保護(hù)率較低，而QXL87疫苗株對(duì)部分QX型強(qiáng)毒株感染的保護(hù)率僅達(dá)到80%，達(dá)不到100%。因此，養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)盡量選擇與當(dāng)?shù)亓餍卸局甑难逍鸵恢碌囊呙缰昝庖卟拍馨l(fā)揮有效的保護(hù)作用[8]。

由于傳染性喉氣管炎無(wú)特效治療藥物，應(yīng)快速淘汰病死雞，對(duì)其他健康雞群飲用抗病毒中藥、轉(zhuǎn)移因子等對(duì)癥治療，以提高雞群的抵抗力。同時(shí)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果在飼料中添加健牧茶多酚，并與阿莫西林棒酸飲水配伍連用5 d治療大腸桿菌感染。結(jié)果，發(fā)病雞群采食逐漸恢復(fù)正常，死淘率下降，7 d后該養(yǎng)殖場(chǎng)病情得到有效控制。

4 結(jié)論

此次發(fā)病為ILTV、FAdV-4、IBV和大腸桿菌混合感染，免疫ILTV活疫苗可能是造成此次疫情的誘因。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊鵬， 陳靜， 尹德晶，等. 雞傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、鴨源雞桿菌混合感染病例的病原學(xué)診斷[J].貴州畜牧獸醫(yī)， 2020， 44（03）：44-48.

[2] Thilakarathne DS， Hartley CA， Diaz-Méndez A， et al.Latency characteristics in specific pathogen-free chickens 21 and 35 days after intra-tracheal inoculation with vaccine or field strains of infectious laryngotracheitis virus[J]. Avian pathology， 2020，49（4）：369-379.

[3] G Z Tong ， S J Zhang， L Wang， et al. Protection of chickens from infectious laryngotracheitis with a recombinant fowlpox virus expressing glycoprotein B of infectious laryngotracheitis virus[J].Avian pathology， 2001， 30（2）：143-148.

[4] 張紹杰，倪健強(qiáng)，孟松樹(shù)，等. 傳染性喉氣管炎病毒王崗株糖蛋白gB 基因在重組桿狀病毒中的表達(dá)[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001， 23（5）：321-324.

[5] 王云峰，智海東，王玫，等. 表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB 基因重組雞痘病毒疫苗的安全性試驗(yàn)與最小免疫劑量測(cè)定[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001， 23（6）：441-444.

[6] Tsiouris V， Mavromati N， Kiskinis K， et al. A Case of Infectious Laryngotracheitis in an Organic Broiler Chicken Farm in Greece[J].Veterinary sciences， 2021，8（4）：64.

[7] 秦春芝， 徐懷英， 周萌，等. 肉雞傳染性喉氣管炎的發(fā)生和診斷及其PCR診斷方法的建立[J]. 家禽科學(xué)， 2020 （08）：6-10.

[8] 蘇晉. “雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota株+QXL87株）”對(duì)IBV流行毒株的免疫保護(hù)試驗(yàn)[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2018.