糖尿病腦病動物模型制備方法的研究進(jìn)展

霍明軒，劉偉，王倩，馮波

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256600

糖尿病是一組以高血糖為主要特征的代謝性疾病，可引起糖尿病周圍神經(jīng)病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病與人類認(rèn)知障礙有明顯相關(guān)性［1］，糖尿病腦病于1950年被DEJONG首次提出，總結(jié)了糖尿病的認(rèn)知損害并發(fā)癥［2-3］，NIELON于1965年證實(shí)了糖尿病腦病這一概念，其臨床表現(xiàn)主要為學(xué)習(xí)、記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙，病理變化以神經(jīng)電生理和影像學(xué)異常為主要特征［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)，血糖水平異?？捎绊懤夏晏悄虿』颊叩娜粘Ｐ袨楹颓榫w，糖代謝紊亂可能是晚發(fā)性阿爾茨海默病的始動因子，因此有學(xué)者提出阿爾茨海默病是3型糖尿病的學(xué)說［7］。隨著研究的深入，糖尿病腦病這一概念被逐漸完善，但糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防與治療等尚待進(jìn)一步研究。在做動物實(shí)驗(yàn)之前，需要先制備出理想的糖尿病腦病動物模型。隨著研究的深入，近年已經(jīng)取得一些成果，現(xiàn)綜述如下。

1 糖尿病腦病動物模型常規(guī)制備方法

制備糖尿病腦病動物模型，首先應(yīng)該制備糖尿病動物模型，進(jìn)行學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能評估，篩選出合適的糖尿病腦病動物模型。動物模型的選擇應(yīng)符合以下基本原則：a.選用與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方法等相匹配的標(biāo)準(zhǔn)化等級動物；b.選用與人體結(jié)構(gòu)功能、機(jī)能、代謝及疾病特征相似的動物；c.各種檢測指標(biāo)易于施行；d.實(shí)驗(yàn)動物易獲得、經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)管理［8］。糖尿病動物模型按照制備方法不同，分為實(shí)驗(yàn)性動物模型、自發(fā)性動物模型、基因工程動物模型。

1.1 實(shí)驗(yàn)性動物模型實(shí)驗(yàn)性糖尿病動物模型是指通過手術(shù)方法、化學(xué)試劑和高脂飲食等人工誘發(fā)的具有糖尿病特征的動物模型，具有價(jià)格便宜、方法簡便、易于誘導(dǎo)和維持的特點(diǎn)。

1.1.1 手術(shù)方法1889年，德國的MINKOWSKI最早通過切除犬胰腺，制備第一個(gè)糖尿病動物模型。全胰腺切除術(shù)誘發(fā)的糖尿病模型比較穩(wěn)定，但胰島素缺乏可出現(xiàn)尿糖、高血糖和酮癥酸中毒，不治療動物將會死亡［9］。雖然全胰腺切除術(shù)是一類比較安全的手術(shù)，但存在十二指腸壞死并發(fā)癥可能，并且手術(shù)切除有造模繁瑣、術(shù)后感染等缺點(diǎn)，僅少數(shù)大動物適用，因此不宜選擇胰腺切除的方法制備糖尿病腦病動物模型。

1.1.2 單純高糖高脂飲食誘導(dǎo)法高糖高脂飲食可以誘發(fā)胰島素抵抗，該機(jī)制可能為營養(yǎng)過剩導(dǎo)致游離脂肪酸和氨基酸的增加直接導(dǎo)致胰島素抵抗［10］。特殊膳食誘導(dǎo)糖尿病模型首先由HOUSSAY和MARTINEZ在1947年報(bào)道。席守民等［11］給予貴州小香豬高脂高蔗糖（含10%豬油，37%蔗糖）飼料喂養(yǎng)，3個(gè)月后出現(xiàn)高脂血癥和高血糖癥，建立了較理想的2型糖尿病模型，但小香豬價(jià)格昂貴且造模時(shí)間較長，不適合作為糖尿病腦病動物模型。也有人用清潔級近交系雌性Wistar大鼠建立糖尿病模型，方法為用高糖高脂飼料（其中含20.0%蔗糖，10.0%豬油，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料）飼養(yǎng)Wistar大鼠1個(gè)月，喂養(yǎng)1個(gè)月后24 h攝食量、體質(zhì)量明顯增加，血清甘油三酯、膽固醇水平也升高明顯，血糖血脂水平均較常規(guī)飼料組高；并且計(jì)算獲得的胰島素敏感指數(shù)也高于對照組［12］，胰島素敏感指數(shù)與對照組相比有顯著性差異，從而成功建立了較理想的糖尿病動物模型。此種方法經(jīng)濟(jì)、簡便易行，可作為糖尿病腦病動物模型的誘導(dǎo)方法［13-15］。

1.1.3 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法鏈脲佐菌素（STZ）是一種抗菌及抗腫瘤藥物，由SZKUDELSKI等［16］1963年首次報(bào)告有致糖尿病作用，STZ通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT2）獨(dú)自進(jìn)入某些種屬動物（大鼠、小鼠、猴、羊、狗等）的胰島β細(xì)胞，從而破壞胰腺β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素缺乏。KOLB等［17-18］在1976年首次通過單次靜脈或腹腔注射的方法，給予小鼠不同劑量的STZ，發(fā)現(xiàn)小劑量的STZ即可誘導(dǎo)出2型糖尿病。研究認(rèn)為，同一種屬動物中STZ致細(xì)胞損傷程度取決于STZ劑量。一次性給予大鼠腹腔或靜脈注射STZ 40～90 mg/kg，可直接破壞胰島β細(xì)胞；也可注射STZ 15 mg/kg，一日3次，通過免疫機(jī)制（T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)）使β細(xì)胞不斷破壞而導(dǎo)致糖尿病。給予成年大鼠注射少量STZ，使少量胰島β細(xì)胞受到破壞，最終引起血糖升高，且用STZ處理新生大鼠，最終導(dǎo)致2型糖尿?。?9-20］。四氧嘧啶的作用除了抑制葡萄糖激酶、誘導(dǎo)活性氧簇，還可以通過破壞某些種屬動物胰島β細(xì)胞，最終導(dǎo)致糖尿病。有研究者曾用四氧嘧啶誘導(dǎo)清潔級ICR種小鼠制備糖尿病模型，但模型的制備受藥物劑量、藥物注射方法、小鼠性別、周齡、禁食時(shí)間等諸多因素影響，并且四氧嘧啶比STZ對肝腎組織造成的毒性更大，酮癥發(fā)生率也較高，因此我們建議不采用四氧嘧啶誘導(dǎo)法制備糖尿病模型［20-22］。有報(bào)道稱，聯(lián)合使用STZ（30 mg/kg）+四氧嘧啶（50 mg/kg）可以制備糖尿病動物模型，這種方法減少了每種試劑的劑量，降低了毒性，增加了造模成功率，并且因STZ的用量減少而降低了成本。但是該方法制備的模型更類似于人類1型糖尿病模型，所以不推薦用此方法制備糖尿病腦病模型［23］。

1.1.4 高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ法目前最常用的實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病動物模型建立方法是高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ。2型糖尿病是一種異質(zhì)性疾病，其特征是胰島素作用（胰島素抵抗）逐漸減弱，隨后β細(xì)胞無法補(bǔ)償胰島素抵抗（胰腺β細(xì)胞功能障礙），導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡，最后發(fā)展為糖尿病，其特征為中度高血糖、高血脂、胰島素抵抗［24-25］。因此先用高糖高脂飲食誘發(fā)胰島素抵抗，再通過注射STZ破壞胰腺β細(xì)胞，制備糖尿病動物模型。具體方法：選用清潔級Wistar大鼠/SD大鼠，以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，有研究者又加用了果糖飲水，其中高糖高脂飼料配比各研究者使用不一，但致胰島素抵抗的目的相同。喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射STZ（溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.4），STZ劑量在25～35 mg/kg。2周后大鼠空腹血糖明顯增高，符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)出現(xiàn)胰島素敏感性下降、胰島素抵抗及高胰島素血癥。此方法所建大鼠模型與人類2型糖尿病的疾病特點(diǎn)相似，造模成功率高，為我們提供了較理想的研究糖尿病腦病的模型［25-28］。

1.2 自發(fā)性動物模型自發(fā)性動物模型是指沒有經(jīng)過人工干預(yù)，實(shí)驗(yàn)動物在自然情況下發(fā)生糖尿病的模型，可以在很大程度上模擬人類糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中具有較大的臨床意義。自發(fā)性的2型糖尿病常用模型有GK大鼠、KKAy小鼠、Zucker大鼠、NSY小鼠、中國地鼠等［29］。有研究者已用KK-Ay小鼠作為模型研究糖尿病腦?。?0］。但自發(fā)性動物模型因價(jià)格較昂貴，飼養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，繁殖率低等缺點(diǎn)而限制其廣泛應(yīng)用。

1.3 基因工程動物模型基因工程動物模型是指借助基因工程技術(shù)控制動物基因表達(dá)，使動物獲得特有的遺傳特性。其中2型糖尿病被認(rèn)為是多基因異常疾病，目前已開發(fā)出多種轉(zhuǎn)基因或基因剔除小鼠糖尿病模型。用此模型做糖尿病科研科學(xué)性強(qiáng)，但技術(shù)復(fù)雜，目前國內(nèi)尚無條件普遍開展［29］。

上述制備糖尿病動物模型的方法可導(dǎo)致腦內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)障礙，通過上述方法制備2型糖尿病動物模型后，需要再次通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行認(rèn)知功能評估，篩選出有認(rèn)知功能障礙的糖尿病動物模型即糖尿病腦病動物模型。

2 糖尿病腦病動物模型側(cè)腦室注射制備法

STZ在外周可以選擇性破壞胰島細(xì)胞，在中樞可以引起胰島素受體自身磷酸化和內(nèi)在的酪氨酸激酶活性降低，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)障礙［31-32］。研究表明，胰島素對神經(jīng)細(xì)胞是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，長時(shí)間缺乏會造成神經(jīng)元退行性變，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［32-33］。因此有研究者用STZ側(cè)腦室注射的方法來制備糖尿病腦病模型。具體方法為：選用清潔級C57BL/6小鼠，經(jīng)5%異氟醚麻醉，以氧氣為載體，術(shù)中維持在2%～3%。將小鼠固定于腦立體定位儀上，消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜，每側(cè)側(cè)腦室注射STZ 3 mg/kg各1.5μL，注射速度為0.5μL/min，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)14 d，然后進(jìn)行認(rèn)知功能評估，即可獲得糖尿病腦病動物模型［34］。

3 糖尿病腦病動物模型的篩選方法

糖尿病腦病動物模型的篩選方法以Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛，其次還包括新物體識別實(shí)驗(yàn)、抑制性回避任務(wù)等。研究表明，有60%～70%的糖尿病患者存在輕中度認(rèn)知功能缺損，認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)為語言、記憶和復(fù)雜信息的處理能力下降，臨床主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退［35］。

3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮由圓形的水池，可移動位置并隱藏在水面下的平臺、圖像自動采集處理系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)對象為大鼠時(shí)，水迷宮直徑為160～180 cm，水池內(nèi)水溫保持在（25±1）℃；為小鼠時(shí)，水迷宮直徑為100～120 cm，水溫保持在21～22℃。水迷宮高度均為50 cm，水中可適當(dāng)加入牛奶或無毒染料，水池內(nèi)壁被漆為黑色。迷宮上方安裝記錄動物模型運(yùn)動軌跡的攝像機(jī)，池壁上以4個(gè)等距點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限中心放有直徑為10 cm、高30 cm的表面粗糙平臺。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括定位航行和空間探索，實(shí)驗(yàn)第1天將鼠放入水池中自由游泳適應(yīng)60～120 s，第2天起將平臺置于目標(biāo)象限，面向池壁將動物放入水中，每日4次（4個(gè)不同的象限各一次），每次訓(xùn)練時(shí)間60 s，每次間隔15 s，共訓(xùn)練4～5 d，找到平臺后允許動物在平臺上滯留10 s并記錄逃避潛伏期（動物進(jìn)入迷宮到找到平臺的時(shí)間），如果動物未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺，則引導(dǎo)其在平臺上停留10 s，潛伏期記錄為60 s。定位航行結(jié)束后24 h，移除平臺，任選一點(diǎn)將鼠放入水中，記錄在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（60 s）第一次跨越平臺時(shí)間、跨越平臺次數(shù)等指標(biāo)。此實(shí)驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格遵循操作程序及注意事項(xiàng)，以獲得可靠數(shù)據(jù)［36-38］。

3.2 新物體識別實(shí)驗(yàn)ENNACEUR等［39］在1988年報(bào)道了用于檢測嚙齒類動物空間記憶能力的新事物與新位置識別實(shí)驗(yàn)。具體方法為：將鼠放置在一個(gè)不透明的開放場室里，允許探索1 min以熟悉環(huán)境，然后放入家籠中1 min，此時(shí)將兩個(gè)相同的物體放入兩個(gè)相對的角落，再將鼠放置在開放場室，記錄3 min內(nèi)探索兩個(gè)物體的時(shí)間。利用嚙齒類動物喜歡探索陌生事物的天性，間隔24 h后，將熟悉的物體與一個(gè)新的物體配對，再次將鼠置于開放場室，記錄3 min探索時(shí)間。其中每個(gè)步驟后均用60%酒精清洗盒子和物體，避免氣味痕跡干擾。最后用認(rèn)知指數(shù)（RI）評價(jià)認(rèn)知功能，RI的計(jì)算方法是將新目標(biāo)探索時(shí)間除以總探索時(shí)間，RI值大于0.5表示動物喜歡探索新奇物體［36-40］。

3.3 抑制性回避任務(wù)抑制性回避任務(wù)需要準(zhǔn)備一個(gè)由大小相同的亮室和暗室組成的回避裝置，兩室間由可移動的門連接。利用嚙齒類動物偏愛黑暗環(huán)境的天性，將大鼠放在亮室里，然后打開中間門，當(dāng)大鼠由亮室完全進(jìn)入暗室時(shí)，足部將會遭遇一次電擊。測試結(jié)束后24 h，再次將大鼠放入亮室進(jìn)行同樣的測試，記錄大鼠從亮室進(jìn)入暗室的時(shí)間（潛伏期），潛伏期越長，表示大鼠記憶越好［36］。

綜上所述，目前應(yīng)用最多的糖尿病腦病模型為高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ的方法，另外，高糖高脂飲食誘發(fā)胰島素抵抗、小劑量STZ靜脈或腹腔注射選擇性破壞胰島β細(xì)胞等方法也可制備糖尿病腦病動物模型。若經(jīng)濟(jì)條件及飼養(yǎng)條件允許，可以應(yīng)用自發(fā)遺傳性動物；若手術(shù)條件允許，也可以采用側(cè)腦室注射STZ的方法。上述方法制備糖尿病動物后，再進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識別實(shí)驗(yàn)、抑制性回避任務(wù)等進(jìn)行認(rèn)知功能評估，篩選出糖尿病腦病動物模型。實(shí)驗(yàn)動物是糖尿病腦病研究的基本條件及有力工具，至今為止，還沒有一種動物模型能夠完全模擬糖尿病腦病的發(fā)生及發(fā)展過程，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)綜合各種因素，選擇最適合自己試驗(yàn)的模型。