PELP1在肝癌中的作用及分子機制研究*

劉星吟，王 芳，王攀琦，劉 洋，劉復興，寧志豐

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院基礎醫(yī)學院)

肝癌的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第5位，是全球最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居于第3位[1]。肝癌在我國高發(fā)，主要風險因素包括感染乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，長期食用黃曲霉毒素污染的食物、酗酒，長期大量吸煙以及肝硬化等[2]。目前主要的治療手段是手術切除、放化療及介入治療等。但是由于發(fā)病機制并不明確以及早期診斷率低，甲胎蛋白(AFP)在早期肝癌中靈敏度小于40%[3]，五年生存率和總生存率仍處于較低水平。隨著研究水平不斷改進更新，靶向治療成為一大熱點，因此，探究針對肝癌的新治療靶點意義重大。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-，glutamie acid-，leucine-rich protein 1，PELP1)是一種具有多功能的新型核受體輔助調節(jié)因子，定位于染色體區(qū)域17p13.2，并編碼1130個氨基酸的蛋白質[4-5]。PELP1作為一種支架蛋白，與多種癌癥發(fā)生發(fā)展有密切關系(如染色質重塑和DNA修復)[6]。Gonugunta等[7]研究證實PELP1中具有兩個核仁結構域在PELP1介導的核糖體功能中起重要作用。有研究報道[8]PELP1是潛在的原癌基因，動態(tài)的穿梭在細胞質和細胞核之間，在多種癌癥(尤其是性激素敏感或性激素無反應的癌癥)，如乳腺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、腎細胞癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、膠質母細胞瘤等中都高表達[9-16]。PELP1具有癌基因的特征，可間接影響細胞信號轉導和細胞過程[17]，并且在多種腫瘤樣本組織中高表達，加速細胞周期、抑制細胞凋亡、誘導上皮-間質轉化、增強腫瘤細胞遷移侵襲能力和耐藥性等，它可能成為判斷腫瘤預后的標志物和腫瘤治療的作用靶點。

目前PELP1對于肝癌的作用尚不清楚，最近通過Oncomine數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)PELP1在肝癌細胞株或者組織中高表達，預實驗應用Western blot驗證顯示PELP1在肝癌細胞中比正常肝組織表達含量高。通過小干擾 RNA (siRNA) 沉默PELP1可抑制肝癌細胞的活力、增殖作用、克隆形成能力、遷移和侵襲能力。沉默PELP1后伴隨著STAT3信號通路及下游分子下調。因此，本文就PELP1在肝癌中發(fā)生、發(fā)展的作用為肝癌臨床靶向治療提供一些基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞系和培養(yǎng)物

人肝癌細胞(HepG2細胞)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細胞均在DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基輔以10%胎牛血清 (Gibco)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素中培養(yǎng)。

1.1.2 抗體和試劑

在蛋白免疫印跡實驗中闡明所需抗體。轉染試劑Lipofectamine 2000TM Transfection Reagent購自invitrogen公司。三對PELP1-homo-1、PELP1-homo-2、PELP1-homo-3是利用Ambion網(wǎng)站上的免費在線工具設計，由中國的吉瑪基因公司合成。siRNA 序列見表1。

表1 PELP1-homo序列

1.1.3 生物信息學

PELP1在肝癌組織或細胞系的mRNA表達獲自Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)。另外PELP1調控的通路信息獲自BioCarta(https://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta-Pathways)。

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測細胞中PELP1的蛋白表達水平

收集轉染后的細胞，總蛋白的提取采用RIPA緩沖液(1%TritonX-100，50mM Tris-HCl pH7.2，0.1%SDS和1mM EDTA，150mM NaCl，1%脫氧膽酸鈉)。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度測定。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離蛋白，然后將蛋白質轉移PVDF上。將洗干凈的PVDF膜放置于配好的封閉液(5%脫脂牛奶或5%BSA)中孵育1h，搖床設定50round/min與以下一抗PELP1抗體(A3189，1∶2000，ABclonal)，STAT3抗體(A19566，1∶2000，ABclonal)、Phospho-stat3-Y705(AP0705，1∶2000，ABclonal)和小鼠多克隆GAPDH抗體(SC-47724，1∶5000)在4 ℃下孵育過夜。配置超敏ECL工作液，顯影，最后通過掃膜儀掃膜，以GAPDH為內參，用目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值來表達目的蛋白水平。實驗重復3次。

1.2.2 細胞轉染

PELP1-homo-1、PELP1-homo-2、PELP1-homo-3、Negative control購于吉瑪基因(中國上海)。取對數(shù)生長期的肝癌細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，將密度為2×106/孔的HepG2細胞接種在6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，直至細胞融合達70%～90%。根據(jù)使用說明書，通過Lipofectamine 2000TM(Invitrogen)處理轉染，分為PELP1-homo-3敲低組及NC對照組。轉染48h后用Western blot進行轉染效率的檢測。

1.2.3 細胞活力測定

用CCK-8試劑盒測定細胞活力和增殖活性。將肝癌細胞與100μL的培養(yǎng)基(2×103/孔)一起培養(yǎng)。將轉染肝癌細胞和對照組細胞以每孔2000個細胞的密度接種于96孔板(Costar)的完全培養(yǎng)基(添加10%FBS，1%p/s的DMEM)中，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱標準條件下分別孵育12、24、48、72、96h，每孔總體積為100μL。到達固定的時間，向各孔中加入10μL CCK-8后在培養(yǎng)箱孵育2h，使用酶標儀在450 nm處記錄光密度值。

1.2.4 平板克隆形成實驗

通過平板菌落形成測定檢查集落形成能力。將轉染肝癌細胞與NC組接種到6cm平板(Costar)中，密度為100、300、500個細胞/板，然后在標準條件(37 ℃和5%CO2)下孵育約7d。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細胞3次，然后用甲醇固定20min，用0.1%結晶紫染色25min后，在光學顯微鏡下以100×放大倍數(shù)計數(shù)直徑超過50μm的菌落數(shù)。通過將陽性菌落數(shù)除以接種的細胞總數(shù)來計算菌落形成速率。

1.2.5 細胞劃痕實驗

將轉染PELP1-homo-3實驗組與NC組接種到6cm平板(Costar)中，每孔的密度為5×105/孔，每孔3mL的培養(yǎng)基，在5% CO2和37℃孵箱中培養(yǎng)24h，待細胞密度達到80%～90%，將孔內培養(yǎng)液吸去，用10μL槍頭垂直于孔板劃痕，用PBS輕柔沖洗3遍后，加入培養(yǎng)基3mL后將細胞置于5% CO2和37℃的孵箱內培養(yǎng)。分別于0、6、12、24、48h觀察各組細胞向劃痕中遷移的情況。計算劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell侵襲和遷移試驗

為了觀察Transwell小室遷移情況，首先將肝癌細胞進行饑餓6h，然后使用無血清培養(yǎng)基重懸，之后將200μL細胞混懸液添加于上室中，下室給予含有20%FBS的DMEM。將轉染PELP1-homo-3實驗組和對照組NC(5×104個/孔)接種在小室(COSTAR)中。培養(yǎng)48～72h，小室用甲醇固定20min，0.1%結晶紫染色溶液染色25min，用棉簽除去未遷移或侵入孔的細胞。用顯微鏡從5個不同的顯微鏡視野計數(shù)膜底部的細胞并計算平均值。遷移和侵襲實驗相同的實驗方案，而侵襲實驗的上室存在基質膠Matrigel，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按8∶1比例稀釋Matrigel，將Matrigel鋪在Transwell小室上室，放入培養(yǎng)箱37℃靜置30min取出。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PELP1對肝癌細胞增殖的影響

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫評估肝癌及鄰近正常組織中PELP1的表達水平(如圖1)。發(fā)現(xiàn)肝癌組織與正常肝組織相比，PELP1在肝癌組織中顯著過表達。CCK-8檢測結果提示，沉默PELP1后與對照組NC對比，HepG2細胞活力在72h與96h明顯降低(P<0.01)，如圖2。沉默PELP1對肝癌細胞的增殖能力有抑制作用，且呈時間依賴性，該增殖作用隨著時間的延長而降低。

圖1 肝癌與正常組織的PELP1表達水平

圖2 沉默PELP1后12h、24h、48h、72h、96h與對照組細胞活力對比(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 PELP1對肝癌細胞平板克隆形成能力的影響

平板克隆實驗主要評價單個細胞的增殖能力，PELP1-homo-3實驗組與NC對照組相比，肝癌的克隆形成率顯著降低，增殖能力受到顯著抑制，具有統(tǒng)計學意義(如圖3、4)。

圖3 沉默PELP1組與對照組NC克隆形成圖

(*P<0.05)

2.3 PELP1對肝癌細胞侵襲和遷移的影響

劃痕實驗以及遷移實驗，侵襲實驗結果提示，從48h組(圖5、6)和72h組(圖7、8)分別得出，沉默肝癌細胞的遷移能力明顯低于NC組，具有抑制作用。PELP1-homo-3實驗組有顯著減弱肝癌細胞的侵襲能力的作用。劃痕實驗結果提示沉默PELP1表達抑制了HepG2的遷移[如圖9(封三)，圖10～11]。

2.4 沉默PELP1可影響肝癌細胞中STAT3信號通路

通過Western blot實驗驗證PELP1與STAT3信號通路的關系。預實驗顯示PELP1-homo-3效果最佳(圖12、13)。經(jīng)過Western blot實驗顯示轉染PELP1-homo-3后HepG2細胞中PELP1表達下調。在STAT3信號通路中，磷酸化 STAT3則在PELP1沉默后蛋白表達水平顯著降低(圖14～17)?？傊?，本實驗相關數(shù)據(jù)顯示表明沉默PELP1可以通過減少STAT3的磷酸化在體外抑制肝癌細胞的惡性特征。

圖12 預實驗的Western blot 圖13 預實驗灰度值統(tǒng)計圖

3 討 論

肝癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[18]，該疾病可由多種因素導致，早期診斷率較低，一般發(fā)現(xiàn)已經(jīng)進入肝癌晚期。目前肝癌的靶點仍然未闡明，發(fā)病機制尚不清楚，雖然肝移植和肝切除術是可以治愈一些患者，但是復發(fā)性較強，所以，迫切需要一種新的治療策略。PELP1是一種參與基因組和非基因組雌激素信號轉導的支架蛋白，同時PELP1是雌激素受體(ESR1和ESR2)的共激活因子[19]，雖然PELP1在肝癌中的作用尚未完全闡明，但相關研究表明，雌激素受體α參與了肝癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在細胞內高表達尚認為它是致瘤的因素[20]。

通過本次研究我們發(fā)現(xiàn)PELP1對于肝癌的生長活力、遷移能力和侵襲能力有顯著的抑制作用，并且還參與調控STAT3的信號通路及下游分子。目前PELP1參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，尤其是在一些依賴雌激素的腫瘤中表達顯著。有研究證實，PELP1對于乳腺癌、髓母細胞瘤、腎上腺癌具有潛在的診斷和預后價值起著重要作用[21]；還有研究利用抑制雄激素受體(AR)-PELP1相互作用而發(fā)揮抗癌活性的作用[22]；另有研究證實PELP1作為一個關鍵的內質網(wǎng)協(xié)同調節(jié)因子在大腦中介導17β-雌二醇(E2)信號和動作，抑制促炎效應[5，23]；PELP1也是激素依賴型婦科惡性腫瘤的潛在原癌基因，被確定為胃癌、結腸癌、食管癌的潛在標記物[8，10，24]。雖然PELP1在體內的意義仍然不清楚，且肝癌的發(fā)生發(fā)展過程復雜，分子機制尚待闡明，分子靶向治療是一種新型有效的肝癌治療，目前正處于發(fā)展熱點。

由于PELP1在肝癌中高表達，但在肝癌的發(fā)生發(fā)展的過程中所扮演的角色尚不清楚，鑒于PELP1在肝癌中的作用，我們探索了潛在的分子機制PELP1沉默調節(jié)肝癌。最近一項研究提示肝癌中存在雌激素受體，如miR-939-3p與雌激素受體1(ESR1)的潛在結合靶點[25]。有研究提示，STAT3信號通路在肝癌細胞中有傳遞信號和啟動基因轉錄的作用[26]。PELP1可激活STAT3信號通路，參與腫瘤的增殖分化，轉移侵襲等過程。我們目前研究證實，siRNA沉默的PELP1下調STAT3以及磷酸化STAT3的表達?？傊甈ELP1可能對肝癌患者的預后有重要意義。