西維來司他對急性肺損傷小鼠NLRP3炎癥小體的作用研究*

韓艷奇，高志丹，陳清杰，黃翠萍

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.湖北科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院)

西維來司他(sivelestat，SV)是一種選擇性中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，已被報道對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的倉鼠、豚鼠和綿羊肺損傷有效[3-4]。在日本進(jìn)行的Ⅲ期和Ⅳ期研究顯示[5-6]，SV能縮短患者機(jī)械通氣時間和重癥監(jiān)護(hù)病房的停留時間，延長急性肺損傷患者的生存期。但SV與NLRP3炎癥小體的關(guān)系研究甚少，本研究通過脂多糖LPS復(fù)制急性肺損傷小鼠模型，檢測肺組織NLRP3炎癥小體及其相關(guān)信號分子的表達(dá)變化，探討SV對急性肺損傷小鼠肺組織的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑與動物

32只7周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為22～26g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。LPS購自北京索萊寶科技有限公司(L8880-10mg)；OLT 1177購自上海易匯科技有限公司(HY-W011082)；SV購自上海易匯科技有限公司(HY-17443)；ELISA試劑盒購自武漢赫爾生物科技有限公司(SU-BN20174)；NLRP3抗體購自CST(15101S)；CASPASE-1購自ABclonal(A0964)；p-NF-κB抗體購自ABclonal(AP0123)；NE(ELANE)購自ABclonal(A13015)；IL-18購自Immunoway(YN1926)；IL-1β購自Immunoway(YT2322)；β-actin抗體購自ABclonal(AC026)；BCA蛋白定量試劑盒，購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2 儀器

水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek 公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與實(shí)驗(yàn)分組

將32只C57BL/6小鼠在標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)間內(nèi)，給予無菌水和食物飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為4組(每組8只)：正常對照組(CON)、模型組(LPS)、模型+SV組(LPS+SV)、模型+NLRP3抑制劑組(LPS+OLT)。正常對照組腹腔注射生理鹽水(20mg/kg)；模型組腹腔注射LPS (20mg/kg)，制備急性肺損傷(ALI)模型；SV治療組在造模前5d每天腹腔注射SV(100mg/kg)；NLRP3抑制劑組在造模前12h內(nèi)腹腔注射OLT 1177(200mg/kg)，分5次給藥，最后一次腹腔注射OLT 1177(40mg/kg)1h后，腹腔注射LPS(20mg/kg)。4組小鼠均12h后處死，留取標(biāo)本，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1 開發(fā)主體環(huán)保意識薄弱 旅游資源作為一種資源，不論是可再生還是不可再生，在其使用過程中不可避免會受到破壞，絕大多數(shù)生態(tài)旅游資源都具有破壞容易恢復(fù)難的特性。隨著景區(qū)知名度的提升，加上游客日益多樣化的需求，旅游目的地不得不想辦法對資源進(jìn)行深度的挖掘和再次開發(fā)。受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，常常使得旅游開發(fā)具有盲目性，可能會使得資源過度開發(fā)而超過自身恢復(fù)限度。張家界國家森林公園，由于對修建性建設(shè)項(xiàng)目控制不夠，造成水質(zhì)污染，曾被聯(lián)合國教科文組織亮出黃牌警告，當(dāng)?shù)卣疄榱嘶謴?fù)景區(qū)原貌，花費(fèi)了上億元人民幣。

1.2.2 肺含水量測定

取右肺上葉，吸水紙吸干表面水分及血液，稱重。置于80℃烘箱72h后稱量肺干重，計(jì)算濕干重之比(W/D)。

1.2.3 小鼠肺組織中IL-1β表達(dá)水平

小鼠頸椎脫臼處死，取右肺下葉部分組織，稱重，加入PBS緩沖液(組織∶PBS=1∶9)，冰上剪碎組織，采用研磨儀充分勻漿，收集上清。通過酶聯(lián)免疫法檢測肺組織中IL-1β的表達(dá)水平，操作均按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白以及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶表達(dá)水平

取適量肺組織，稱重，加入一定體積比例(組織∶RIPA=1∶30)的RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑A液、磷酸酶抑制劑B液混合液(RIPA∶PMSF∶PA∶PB=100∶1∶1∶1)，在碎冰上剪碎組織，冰上靜置20min，裂解小鼠肺組織，利用研磨儀勻漿，離心，取上清，酶標(biāo)儀562nm波長條件下進(jìn)行蛋白定量，蛋白含量采用BCA試劑盒檢測。定量后的蛋白樣品取10μL進(jìn)行上樣，采用8%～15%的SDS-PAGE分離膠進(jìn)行蛋白電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜2h，室溫下用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測NLRP3、p-NF-κB、CASPASE-1、IL-1β、IL-18、NE蛋白的表達(dá)變化。

1.2.5 肺組織病理損傷觀察

取各組小鼠右肺中葉組織，迅速放入4%多聚甲醛液中固定，脫水，石蠟包埋，切片，然后用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠臨床表現(xiàn)

CON組小鼠活動狀態(tài)正常，正常攝食、正常飲水。模型組在腹腔注射LPS 12h時，出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、精神萎靡、呼吸淺快或深快、節(jié)律不齊，時有呼吸困難、眼神渙散。小鼠均存活，無死亡。

2.2 肺含水量比較

與CON組相比，LPS組小鼠肺W/D升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+SV組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS+OLT組與LPS組比較有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖1。

與CON組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

2.3 肺組織中炎癥因子IL-1β含量的比較

ELISA法測定結(jié)果顯示，與CON組比較，LPS組IL-1β表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；LPS+SV組IL-1β表達(dá)水平較LPS組高，而LPS+OLT組IL-1β表達(dá)水平較LPS組低(P<0.05)，作用與CON組相當(dāng)(見圖2)，此結(jié)果表明，SV不能夠抑制NLRP3炎癥小體下游的炎癥因子IL-1β的釋放。

與CON組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

2.4 SV對NE蛋白的影響

如圖3所示，Western blotting結(jié)果顯示：與CON組相比，LPS組中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)表達(dá)顯著性增多(P<0.05)；SV作為一種選擇性中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，與LPS組相比較，能夠顯著性抑制NE的表達(dá)(P<0.05)，且治療作用與CON組相當(dāng)；而NLRP3炎癥小體抑制劑并沒有降低NE的表達(dá)。

與CON組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05

2.5 SV對p-NF-κB蛋白的影響

Western blotting法檢測各組小鼠肺組織中的p-NF-κB蛋白表達(dá)變化，結(jié)果見圖4。與CON組比較，LPS組p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+SV組p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；同時，OLT 1177作為NLRP3炎癥小體特異性抑制劑，抑制了p-NF-κB蛋白表達(dá)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義(P>0.05)。

與CON組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01

2.6 SV對NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的影響

Western blotting法檢測各組小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及IL-1β的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。與CON組相比，LPS組NLRP3蛋白表達(dá)顯著性增多(P<0.01)，CASPASE-1、IL-18以及IL-1β蛋白表達(dá)均顯著性增多(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+SV組中NLRP3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)、CASPASE-1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)、IL-18蛋白表達(dá)顯著性降低(P<0.01)、IL-1β蛋白的表達(dá)變化并沒有降低(P>0.05)，LPS+OLT組中的IL-1β蛋白表達(dá)顯著性降低(P<0.05)。此結(jié)果說明，SV能夠部分抑制NRLP3炎癥小體的活化。

與CON組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.7 SV對LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察，HE染色結(jié)果顯示(圖6，封二)：CON組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無異樣；LPS組出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，包括炎性細(xì)胞浸潤、肺泡水腫、肺泡壁增厚以及肺泡紊亂；而LPS+SV組以及LPS+OLT組明顯抑制了肺組織的病理學(xué)改變。

3 討 論

急性肺損傷是指在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克等各種致病因素下誘發(fā)的急性、進(jìn)行性呼吸功能不全等癥狀，其主要病理改變?yōu)榉闻?毛細(xì)血管通透性增加、炎性細(xì)胞聚集，臨床上會出現(xiàn)明顯的呼吸窘迫以及頑固性低氧血癥。因其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，急性肺損傷仍然是現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)的重大難題，目前尚無有效的治療方法。

據(jù)報道[7]，炎癥在ALI中起著關(guān)鍵作用，炎癥小體是炎癥相關(guān)疾病的重要治療靶點(diǎn)。炎癥小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，其中NLRP3炎癥小體是當(dāng)代研究熱點(diǎn)之一，可以被細(xì)菌脂多糖(LPS)、K+外流、Ca2+信號、活性氧(ROS)、線粒體功能障礙和溶酶體破裂等多種成分活化[8]。NLRP3受體蛋白含有PYD、NACHT、LRR三個結(jié)構(gòu)域。當(dāng)激動劑接觸受體蛋白時，NLRP3的PYD結(jié)構(gòu)域與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而ASC中的CARD結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)蛋白CASPASE-1的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而活化NLRP3炎癥小體，釋放IL-1β和IL-18，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的浸潤及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致相應(yīng)組織發(fā)生炎性損傷[9]。相關(guān)研究[10]表明，通過生物信息學(xué)預(yù)測，含有3 (NLRP3)的類節(jié)點(diǎn)受體被認(rèn)為是miR-495的一個可能靶點(diǎn)，miR-495啟動子的甲基化可以抑制miR-495的表達(dá)，過表達(dá)miR-495可以抑制NLRP3炎性小體的激活，最終抑制LPS誘導(dǎo)的ALI的發(fā)展。Zhang 等研究[11]顯示，在發(fā)生急性肺損傷的小鼠體內(nèi)，NLRP3炎癥小體被顯著激活并釋放了大量的IL-1β和有活性的CASPASE-1，褪黑素能夠通過抑制細(xì)胞外組蛋白而抑制NLRP3炎癥小體的激活；Cao等[12]認(rèn)為，促紅細(xì)胞生成素可以通過抑制EPOR/JAK2/STAT3信號通路有效抑制NLRP3炎癥小體活化來減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷；枸杞多糖通過介導(dǎo)SIRT1抑制NLRP3炎癥小體的活化而減輕高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷[13]。以上研究充分證明了抑制NLRP3炎癥小體的活化是治療急性肺損傷的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠體內(nèi)，NLRP3、CASPASE-1等蛋白表達(dá)明顯增多，NLRP3炎癥小體明顯被活化，釋放的IL-18以及IL-1β介導(dǎo)了急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)用NLRP3特異性抑制劑預(yù)處理后，顯著降低了NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及IL-1β等炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步改善了肺組織的炎癥浸潤，從而對急性肺損傷起到保護(hù)作用。

作為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，SV可競爭性抑制中性粒細(xì)胞的活化，減少急性呼吸窘迫綜合征過程中的中性粒細(xì)胞浸潤，從而對肺部起到保護(hù)作用[14]。近年來，國內(nèi)外多個動物肺損傷模型均表明SV對肺損傷有保護(hù)作用，主要機(jī)制是減少肺泡中以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，抑制NE產(chǎn)生，并改善肺損傷的癥狀[15-16]，但其與NLRP3炎癥小體的作用尚未明確。本研究結(jié)果提示，SV能夠顯著降低LPS引起的肺損傷小鼠的濕干比，明顯改變肺組織的炎癥浸潤、中性粒細(xì)胞聚集等病理學(xué)改變，抑制肺組織中p-NF-κB、NLRP3、CASPASE-1、IL-18以及NE蛋白的表達(dá)水平，對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷起到保護(hù)作用，但不能減低肺組織中IL-1β蛋白的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，SV作為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，能夠抑制NF-κB介導(dǎo)的p-NF-κB/NLRP3/CASPASE-1/IL-18通路，部分緩解急性肺損傷引起的NLRP3炎癥小體活化。

綜上所述，SV不僅能通過抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的作用來減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，還能通過部分抑制NLRP3炎癥小體活化而緩解急性肺損傷引起的炎癥作用。