棉花雜交種純度SSR分子檢測技術(shù)研究與應(yīng)用

柴莉英 郭志軍 馬寶玲 張珂珂 周關(guān)印

（中棉種業(yè)科技股份有限公司 河南鄭州450001）

棉花生產(chǎn)關(guān)乎著棉農(nóng)的切身利益， 對棉紡織工業(yè)穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義， 一定程度上還拉動(dòng)了我國經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的發(fā)展和進(jìn)步。 隨著棉花科研育種水平的不斷提高，早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等各種優(yōu)良性狀獲得聚合與提高， 滿足了我國多種生態(tài)條件和種植模式的需要[1]。 我國目前棉花生產(chǎn)上主要種植包括早熟棉、中早熟棉、中熟棉等不同熟制要求的常規(guī)棉與雜交棉兩大栽培種類型， 且轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的育成在一定程度上加快了棉種產(chǎn)業(yè)化推廣進(jìn)程， 提升了我國棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展力[2]。

1 我國棉花產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀

“十二五”時(shí)期以來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的深入和棉花種質(zhì)資源材料創(chuàng)新， 我國新審定的棉花品種急劇增長， 科研育種者為保護(hù)自己的知識產(chǎn)權(quán)不受侵犯， 國家植物新品種權(quán)保護(hù)的申請數(shù)量也與日俱增。 因此，我國棉花品種“多、亂、雜”的狀況仍然是棉花生產(chǎn)中非常突出的問題， 切實(shí)做到棉花品種種植區(qū)域化布局也十分困難。 借助新的種子真實(shí)性和純度檢測技術(shù)、加大假冒偽劣種子抽查與檢驗(yàn)力度、切實(shí)加強(qiáng)棉種市場監(jiān)管， 成為維護(hù)棉花育種家權(quán)益和保護(hù)棉農(nóng)根本利益的重要保障措施。

棉花雜交種利用雜種優(yōu)勢聚合多種優(yōu)良性狀于一體，提高產(chǎn)量和改進(jìn)品質(zhì)，屬于高效品種。 好的棉花雜交種在生活力、繁殖力、適應(yīng)性上具有明顯的超親優(yōu)勢。 但雜交種制種用工需求大，成本高，一旦出現(xiàn)問題，影響極大。 如果棉花雜交種子的純度等到大田長成植株時(shí)再通過形態(tài)性狀進(jìn)行鑒定， 一旦出現(xiàn)純度不好或者摻雜使假，不僅會給棉農(nóng)造成損失，對市場上的種子質(zhì)量監(jiān)督和指導(dǎo)也失去了意義。 棉花品種的真實(shí)性和純度差異僅僅依靠傳統(tǒng)的檢測技術(shù)與方法很難進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的判定和區(qū)分， 致使最近幾年雜交棉種生產(chǎn)和市場上假冒偽劣種子時(shí)有發(fā)生，為棉花生產(chǎn)和棉農(nóng)種植帶來極大損失。 因此，采取高效而快捷的現(xiàn)代分子技術(shù)方法， 對雜交棉花種子真實(shí)性和純度進(jìn)行檢測， 加強(qiáng)制種基地與棉種市場的監(jiān)管是重要途徑。

棉花品種的真實(shí)性和純度至關(guān)重要， 一方面它直接影響著棉花的產(chǎn)量和效益， 另一方面也關(guān)系到一個(gè)棉種企業(yè)的質(zhì)量信譽(yù)。

2 我國棉花品種檢測技術(shù)發(fā)展

2.1 形態(tài)鑒定

棉花種子檢測技術(shù)往往以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，可以從籽粒、種苗和植株3 個(gè)不同形態(tài)階段來鑒定。籽粒鑒定應(yīng)用范圍有限， 種苗鑒定通常用于室內(nèi)發(fā)芽率等鑒定。 而植株形態(tài)測定通常作為棉種真實(shí)性和田間純度鑒定的重要方法， 在棉花生長季節(jié)某些特定時(shí)期，通過棉花的株型、鈴型、葉形、絨毛、莖稈、苞葉等主要性狀來綜合判定， 該方法優(yōu)點(diǎn)是田間直接觀察品種真實(shí)性及相關(guān)形態(tài)特征， 缺點(diǎn)是需時(shí)較長， 田間植株形態(tài)性狀表達(dá)易于受基因型與環(huán)境互作影響，某些數(shù)量性狀會出現(xiàn)非遺傳差異[3]。 一些質(zhì)量性狀會因調(diào)查時(shí)間的早晚而得出不同結(jié)論， 其鑒定結(jié)果又與鑒定人員的熟練程度有關(guān)， 難以滿足在調(diào)查過程中快速測定的需要，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，可靠性和時(shí)效性受到一定限制。

2.2 DNA 分子標(biāo)記鑒定技術(shù)

分子生物學(xué)的發(fā)展使DNA 分子標(biāo)記作為種子檢測新的技術(shù)手段更具有優(yōu)勢。 在棉花品種檢測中遇到的分子技術(shù)主要有RAPD 技術(shù)、SSR 技術(shù)、AFLP技術(shù)、RFLP 技術(shù)及SNP 技術(shù)等。目前，應(yīng)用最廣泛的是SSR（簡單重復(fù)序列）技術(shù)，以其簡單、快捷、分辨力強(qiáng)等優(yōu)勢特點(diǎn)得以普遍應(yīng)用。 近年來，采用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純度鑒定、 真實(shí)性檢測及分子育種等應(yīng)用顯著增多。 從鑒定的可信度與時(shí)效性考慮，SSR分子標(biāo)記技術(shù)相比傳統(tǒng)的檢測方法與技術(shù)， 更能滿足棉花品種純度檢測與市場監(jiān)管的需要。

3 利用SSR 檢測技術(shù)的優(yōu)勢

棉花品種真實(shí)性和純度田間小區(qū)種植鑒定存在所需時(shí)間較長、 易于受環(huán)境影響等致命缺陷， 這種“末端鑒定”的事后控制質(zhì)量控制模式，已無法滿足棉花雜交制種基地制種農(nóng)戶種子收購、 種子加工和質(zhì)量檢驗(yàn)等工作的需要， 也不利于品種管理部門對種子市場質(zhì)量的監(jiān)督抽查和管理。 中棉種業(yè)對大容量、 多批次來自制種基地農(nóng)戶的雜交一代棉花種子純度進(jìn)行SSR 分子檢測， 與田間種植純度鑒定結(jié)果進(jìn)行比對分析， 驗(yàn)證了SSR 分子標(biāo)記純度鑒定的相關(guān)性、準(zhǔn)確性及可靠性。 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在棉花雜交種真實(shí)性和純度鑒定上應(yīng)用，能夠?yàn)榻ⅰ笆虑翱刂啤钡拿藁s交種生產(chǎn)質(zhì)量控制模式提供理論基礎(chǔ)，為制定棉花品種DNA 指紋鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)踐依據(jù)，為雜交棉花品種育種者、生產(chǎn)者、消費(fèi)者正當(dāng)權(quán)益提供法律保障， 為我國棉種市場質(zhì)量監(jiān)督抽查和管理提供技術(shù)支撐。

4 SSR 檢測技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用

直接以棉花干種子為DNA 提取試材，既快速又質(zhì)量好， 尤其適用進(jìn)行棉花品種SSR 分子純度快速檢測[4]。對中棉種業(yè)制種農(nóng)戶的樣品進(jìn)行了SSR 純度檢測和田間小區(qū)種植純度鑒定，受檢的91 個(gè)制種農(nóng)戶樣品中DNA 純度最高為95.8%，最低50.0%，平均為86.3%，雜株類型中以親本型為主，占12.5%，初步判斷原因是母本去雄不徹底，形成母本自交鈴， 也存在少量父本的混雜；而對于田間小區(qū)種植純度鑒定，純度最高為99.1%，最低57.5%，平均為94.3%，雜株類型也是以親本型為主，占4.0%，2 種方法的雜株率也都很接近，分別是1.1%和1.7%。2 種試驗(yàn)方法的相關(guān)分析表明，其之間呈高度正相關(guān)[5]。

由此可知， 在制種環(huán)節(jié)的主要問題就是母本去雄不徹底導(dǎo)致的自交鈴， 和一些原因不明的生物學(xué)混雜。 隨著分子檢測的普及，農(nóng)民的質(zhì)量意識增強(qiáng)，懂得分子檢測的準(zhǔn)確度， 加之公司對不合格種子的處罰加大，嚴(yán)禁不達(dá)標(biāo)種子入庫，因此摻雜使假行為減少，總體來看，這些農(nóng)戶批次的種子絕大部分質(zhì)量都不錯(cuò)。從數(shù)據(jù)分析，SSR 鑒定的純度比田間結(jié)果低，可能是存在雜合的基因在性狀上不表達(dá)或者表達(dá)不明顯，從而導(dǎo)致基因水平上的純度低于田間的性狀表現(xiàn)純度，也說明了SSR 分子檢驗(yàn)更加嚴(yán)格，棉花80%純度值可以作為SSR 標(biāo)記純度優(yōu)良的一個(gè)閾值[6-7]。況且田間鑒定受環(huán)境因素影響較大， 一方面由于棉花常異花授粉作物的特殊性，另一方面，檢測人員能力、目測標(biāo)準(zhǔn)、操作方式等人為誤差對大田純度結(jié)果也有影響。

種子收獲后，如果SSR 純度檢測結(jié)果差，公司拒絕收購，農(nóng)戶質(zhì)疑時(shí)，公司會讓農(nóng)戶親自監(jiān)督SSR 檢測工作，從取樣到結(jié)果，讓農(nóng)戶親身感受到分子檢驗(yàn)的權(quán)威性，避免不必要的質(zhì)量糾紛。 有必要時(shí)還會讓農(nóng)戶親自參與調(diào)查來年田間小區(qū)種植的純度鑒定，讓農(nóng)戶認(rèn)識自己制種的純度與質(zhì)量。 另外，還可以通過第三方公證檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對種子進(jìn)行仲裁檢驗(yàn)， 出具當(dāng)事雙方都認(rèn)可的檢驗(yàn)結(jié)果。 種子質(zhì)量是企業(yè)的生命，也是對制種農(nóng)戶的收益保證，對棉花種子市場的安全監(jiān)管也十分重要[8]。 因此，SSR 分子檢測棉花雜交種真實(shí)性和純度技術(shù)應(yīng)用具有廣闊前景。

“十四五”期間國家聚焦農(nóng)業(yè)農(nóng)村領(lǐng)域，圍繞優(yōu)先發(fā)展農(nóng)業(yè)農(nóng)村，解決好“三農(nóng)”問題，作為棉企，有義務(wù)和責(zé)任，提高效益，發(fā)展自身；促進(jìn)棉農(nóng)增收，造福百姓;服務(wù)農(nóng)業(yè)，提高中國棉花競爭力。