現(xiàn)階段草莓莖尖組織培養(yǎng)防褐化分析

潘忠強(qiáng)，尹 濤，邵 陽(yáng)，焦功強(qiáng)

（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島 266100）

0 引言

草莓肉含有蛋白質(zhì)、糖、果膠等營(yíng)養(yǎng)成分，其維生素C含量高于蘋果、葡萄等水果。除新鮮食品外，草莓還可以加工成罐頭、果醬、果酒、飲料等產(chǎn)品。接種培養(yǎng)材料后的組織培養(yǎng)過程中，由于機(jī)械損傷，酚類化合物從傷口流出。曬黑后逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致細(xì)胞中酶活性的增長(zhǎng)，從而影響細(xì)胞的代謝工作。在組織培養(yǎng)中，它傷害了整個(gè)組織，導(dǎo)致組織死亡。草莓栽培過程中，要做好防止草莓莖尖組織培養(yǎng)褐變的工作。

1 相關(guān)試驗(yàn)材料以及方式

1.1 選取的試驗(yàn)材料

選擇生長(zhǎng)較好的紅顏母株進(jìn)行試驗(yàn)，母株上新長(zhǎng)的匍匐莖頂端長(zhǎng)度為：3～4 cm為此試驗(yàn)材料。

1.2 相關(guān)試驗(yàn)處理

1.2.1 外植物體的處理工作。檢驗(yàn)材料浸在自來水中30 min，用洗滌劑處理，用自來水沖洗30 min，用無菌水沖洗3次，然后送到清潔工作臺(tái)消毒。

1.2.2 培養(yǎng)莖尖工作。嫩葉在解剖顯微鏡下從外面一層一層地被剝掉，直到顯露出半圓球形頂端分生組織。選取大小為0.3～0.4 mm的莖尖被切割，接種成三角形瓶（50 mL），從誘導(dǎo)中心灌滿進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種四個(gè)莖尖。為解決草莓早期誘導(dǎo)培養(yǎng)中的褐變問題，介紹了幾種抗褐變措施。上一次測(cè)試完成并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，開始下一次測(cè)試。每次接種練習(xí)10瓶，重復(fù)三次。栽培條件陽(yáng)光光照為1500～2000 Lx，每天12 h，溫度16～22℃。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)。淺綠色愈傷組織出現(xiàn)后，在ms+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L laa+agar10 g/L+30 g/L培養(yǎng)基中接種誘導(dǎo)培養(yǎng)。15～20天后，分化形成的不定芽首次發(fā)芽，同時(shí)根據(jù)草莓繼代增殖培養(yǎng)工作中出現(xiàn)的玻璃化問題進(jìn)行研究，從第一次培養(yǎng)開始進(jìn)行分析。

此試驗(yàn)，對(duì)不同濃度的6-BA培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)置，從而將培養(yǎng)基基礎(chǔ)的成分分為以下幾種：MS+瓊脂10 g/L+蔗糖30 g/L，培養(yǎng)的時(shí)間平均分為25～30天。同時(shí)柱形組織培養(yǎng)瓶分為三個(gè)，選擇350 mL，均透氣的瓶子，進(jìn)行接種工作，接種三個(gè)不定芽，每個(gè)接種十瓶，接種三次，培養(yǎng)的首要條件為1500～2000 Lx，12 h/天，培養(yǎng)的相關(guān)溫度為16～22℃。

1.2.4 培養(yǎng)誘導(dǎo)生根。對(duì)繼代培養(yǎng)工作中，整體的植物株體進(jìn)行接種，選取株體高度為2 cm的試管苗進(jìn)行誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)基選取1/2MS。在15～20天之后，試管苗根生長(zhǎng)到2 cm以上，生根數(shù)達(dá)到2根以上，苗株高達(dá)5 cm時(shí)，進(jìn)行移栽。

1.3 相關(guān)測(cè)試方式以及指標(biāo)

1.3.1 莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)。此外，接種工作后，應(yīng)對(duì)莖尖表面進(jìn)行檢驗(yàn)，如全部變?yōu)楹稚瑒t認(rèn)定該莖尖出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。接種工作結(jié)束后，如莖尖出現(xiàn)膨大愈傷組織等現(xiàn)象，應(yīng)認(rèn)定莖尖誘導(dǎo)后發(fā)生萌發(fā)現(xiàn)象。

褐化率以及萌發(fā)率應(yīng)按照相關(guān)公式進(jìn)行計(jì)算，如褐化率=∑（每瓶褐化莖尖數(shù)/每瓶莖尖數(shù)）每重復(fù)瓶數(shù)×100%，萌發(fā)率=∑（每瓶萌發(fā)莖尖數(shù)/每瓶莖尖數(shù)）每重復(fù)瓶數(shù)×100%。

1.3.2 培養(yǎng)繼代增殖試驗(yàn)工作。培養(yǎng)繼代增殖試驗(yàn)工作中，根據(jù)不同濃度的6-BA續(xù)代，對(duì)培養(yǎng)基試驗(yàn)進(jìn)行三次培養(yǎng)，對(duì)不定芽進(jìn)行接種，在30天后，對(duì)玻璃化以及增殖系數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。此外，對(duì)試管苗的表現(xiàn)進(jìn)行觀察，如試管苗出現(xiàn)透明或半透明現(xiàn)象，或試管苗發(fā)生易碎，組織結(jié)構(gòu)畸形等現(xiàn)象，則認(rèn)定為玻璃化現(xiàn)象。

1.4 相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

Excel 2007用于相關(guān)測(cè)試數(shù)據(jù)的分析，SAS9.0軟件用于統(tǒng)計(jì)分析。成員函數(shù)數(shù)據(jù)用于計(jì)算每個(gè)測(cè)試。會(huì)員函數(shù)的相關(guān)計(jì)算公式為R（X）i=（Xi-Xmin）/Xmax-Xmin。反向成員函數(shù)計(jì)算公式為R（X）i=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），其中Xi表示每個(gè)測(cè)試索引的適應(yīng)性，每個(gè)索引轉(zhuǎn)換以實(shí)現(xiàn)平均值，對(duì)防褐化以及玻璃化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度

6-BA處理對(duì)褐變的影響相比，添加6-BA（p＜0.05）可以顯著提高發(fā)芽率，抑制莖尖的發(fā)芽率（p＜0.05），但隨著6-BA處理濃度的增加，莖尖的發(fā)芽率和發(fā)芽率不會(huì)上升或下降。在所有處理中，A2的發(fā)芽率最高，其次是A3，但二者之間沒有顯著差異。成員功能分析表明A2的發(fā)芽率最高。

CK的曬黑率最高，為91.05%，A3為最低。并非所有效果都能通過評(píng)估發(fā)芽率或曬黑速度得到很好的反映。只有評(píng)估這兩個(gè)指數(shù)，我們才能準(zhǔn)確反映不同治療方法的差異。

2.2 對(duì)于黑暗的預(yù)處理工作以及Vc對(duì)莖尖防褐化分析

黑暗預(yù)處理中，褐化率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，此外與CK進(jìn)行比較分析，兩組差異不明顯，不具備可比性意義。

黑暗預(yù)處理工作中，處理工作達(dá)到2天時(shí)，萌發(fā)率呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但是兩組之間的差異性還是不顯著。

此外，添加V c 后，發(fā)芽率也逐漸提高，兩組（p＜0.05）相當(dāng)，褐色率顯著下降（P＜0.05）。B5的發(fā)芽率最高，褐色率最低。B5和B6治療沒有顯著差異。經(jīng)過計(jì)算和充分分析，B5的總體評(píng)價(jià)值最高，其次是B6。

2.3 不同濃度

比較了6-BA對(duì)草莓芽玻璃的影響。第一次培養(yǎng)后，CK的增殖因子明顯高于其他方法（p＜0.05）。隨著6-BA濃度的降低，隨機(jī)芽增殖系數(shù)下降，一些隨機(jī)芽在CK中結(jié)冰。

第二種培養(yǎng)后，隨機(jī)芽C1的乘法系數(shù)最高，為6.75，但與CK無顯著差異。培養(yǎng)后，每次治療的隨機(jī)芽顯示出不同程度的玻璃，但玻璃率明顯低于CK（p＜0.05）。

按照第三次培養(yǎng)模式，芽增殖不定系數(shù)和單個(gè)處理的玻璃化率明顯低于CK（p＜0.05），芽增殖不定系數(shù)隨濃度下降6-BA呈下降趨勢(shì)，根據(jù)成員功能，C1在第一次、第二次和第三次培養(yǎng)中的總值最高。

合成了第一、第二、第三培養(yǎng)中不定芽的增殖系數(shù)和玻璃化率，并對(duì)平均值進(jìn)行了比較分析。發(fā)現(xiàn)CK中不定芽的倍增系數(shù)最高，為6.30，其次是C1，但C1和CK之間沒有顯著差異。6-BA濃度降低，不定芽的玻璃化率顯著降低，C3的最低值僅為14.14%。此外，還發(fā)現(xiàn)具有成員資格函數(shù)的C1總值最高。

2.4 培養(yǎng)生長(zhǎng)以及褐化、玻璃化

當(dāng)前，通過莖尖組織培養(yǎng)進(jìn)行無病毒苗培育，是市面上快速繁殖草莓以及無毒苗的主要方式。本研究結(jié)果顯示，草莓剝?nèi)デo尖接種培養(yǎng)方式，大致咋3～7天內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)愈傷組織，然而咋在20～25天后，愈傷組織一般會(huì)變?yōu)闇\綠色，在培養(yǎng)35～40天后會(huì)形成不定芽，然后在30天內(nèi)進(jìn)行繼代組織培養(yǎng)，從而形成完整的植株，植株高達(dá)兩厘米，進(jìn)行誘導(dǎo)生根，20天內(nèi)進(jìn)行移栽。

3 結(jié)語(yǔ)

相關(guān)研究表明，褐變主要由苯酚氧化形成，在多酚氧化酶作用下形成喹諾酮。在組織培養(yǎng)中添加抗氧化劑或吸附劑可以防止喹諾酮的形成。Vc作為抗褐變劑也廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中。通過過濾過濾將Vc添加到培養(yǎng)基中可以大大降低銑削莖尖的褐變率，但操作需要大量時(shí)間和勞力。但是，采用VC解決方案浸泡草莓跑步者的端蓋比較容易。Vc溶液濃度為300 mg/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)能顯著降低莖尖的褐變率，從而促進(jìn)外來愈傷組織，并能顯著提高發(fā)芽率。

Vc浸漬時(shí)間達(dá)到9 min后，褐變與控制相比明顯下降，表明褐變只有在一定時(shí)間內(nèi)浸入Vc溶液后才能停止。此外，在培養(yǎng)基中間添加PVP抗氧化劑可以大大降低草莓莖尖的褐變率，也可以促進(jìn)愈傷組織，發(fā)芽率最高可達(dá)100%。但加入活性炭吸附對(duì)褐變沒有明顯影響。

綜上所述，將草莓芽浸泡在Vc溶液中，在培養(yǎng)基中間加入抗氧化PVP，可以大大抑制草莓莖尖的褐變，促進(jìn)草莓莖尖的愈傷組織萌發(fā)。