基于高通量測(cè)序的RNA相互作用研究方法概述

李星橋

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北 武漢 430072

引言

RNA分子在細(xì)胞內(nèi)并不是單獨(dú)行使功能，而是通過(guò)與其他生物分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等發(fā)生交互來(lái)共同完成功能，RNA分子具有堿基互補(bǔ)配對(duì)的內(nèi)在屬性，使得其能形成更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)于多樣的生物學(xué)功能。RNA相互作用，是指RNA分子內(nèi)部以及不同RNA分子間結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)共同調(diào)節(jié)生物體功能[1]。這些互作信息對(duì)于理解RNA的生物學(xué)功能機(jī)制有著十分重要的作用。例如，mRNA的3’UTR目標(biāo)區(qū)域可以被miRNA結(jié)合并抑制其翻譯，lncRNA可以和mRNA結(jié)合促進(jìn)其翻譯[2]，而RNA分子自身也能形成雙鏈，從而產(chǎn)生更加復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合并發(fā)揮功能。因此，如果我們能準(zhǔn)確地獲取細(xì)胞內(nèi)部的RNA相互作用信息，將可以解釋許多分子生物學(xué)功能和機(jī)制。

近年來(lái)，細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模地研究RNA相互作用的方法都是基于高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)。這些測(cè)序技術(shù)能夠用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組范圍的RNA互作，主要包括了PARIS[3]，RIC-seq[4]，hiCLIP[5]等測(cè)序方法。然而，RNA相互作用在生物體內(nèi)是動(dòng)態(tài)變化的，且不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之間存在偏好性，所能檢測(cè)到的RNA種類不同，此外部分實(shí)驗(yàn)方法依賴于特定RNA結(jié)合蛋白，因此不同的技術(shù)得到的RNA互作信息存在差異。根據(jù)具體的分析需求，我們應(yīng)該采用合適的方法用于RNA互作研究。

1 PARlS技術(shù)原理介紹

在RNA互作研究中，各種新技術(shù)層出不窮，PARIS（Psoralen analysis of RNA Interactionsand Structures）是其中較為優(yōu)秀的一種方法。PARIS技術(shù)利用了一種特殊的化學(xué)分子AMT[6]，該分子在365nm的紫外光照射下，可將細(xì)胞內(nèi)RNA雙鏈區(qū)域中的AU堿基對(duì)進(jìn)行交聯(lián)，這種交聯(lián)是基于空間位置。交聯(lián)過(guò)程完成后，將細(xì)胞裂解，接著利用蛋白酶和RNA酶，將細(xì)胞提取物中的蛋白以及未發(fā)生交聯(lián)的RNA去除。之后，根據(jù)雙鏈與單鏈結(jié)構(gòu)的RNA分子在凝膠電泳中移動(dòng)速度存在差異，利用生化中的2D膠對(duì)RNA提取物進(jìn)行電泳，可以進(jìn)一步純化存在雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA，最后切膠并回收得到具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA片段。通過(guò)體外近端連接，將雙鏈RNA連接形成更長(zhǎng)的單鏈并建庫(kù)。最后使用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)得到的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行下游生物信息分析，即可獲取RNA分子在生物體內(nèi)的形成的互作信息。

PARIS方法得到的RNA互作信息是細(xì)胞中的各種類型RNA分子內(nèi)部以及RNA分子間形成的雙鏈結(jié)構(gòu)信息。該技術(shù)最大的創(chuàng)新點(diǎn)是基于化學(xué)分子AMT和紫外光在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)，且無(wú)需RNA結(jié)合至特定蛋白上，因此可獲取各種類型的RNA互作信息，是一種廣泛適用且靈活的方法。此外，PARIS實(shí)驗(yàn)大部分在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，能夠反映出細(xì)胞內(nèi)RNA互作的真實(shí)狀態(tài)。但是PARIS技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，例如細(xì)胞可能受到AMT分子和紫外光等物理化學(xué)因素的影響，實(shí)驗(yàn)最終得到的RNA相互作用信息不可避免地會(huì)受到干擾而與真實(shí)情況存在偏差。

2 RlC-seq技術(shù)原理介紹

類似于PARIS方法，RIC-seq(RNA in situ conformation sequencing)也是測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組范圍的RNA互作信息，不同的是該方法沒(méi)有使用紫外光以及AMT分子進(jìn)行交聯(lián)，而是采用多種不同的酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行處理從而達(dá)到獲取RNA相互作用信息的目的。RIC-seq的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：a.將培養(yǎng)的細(xì)胞用甲醛進(jìn)行固定，接著加入去垢劑處理，增加細(xì)胞的通透性；b.利用微球菌核苷酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行隨機(jī)切割，此時(shí)與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的RNA互作片段將會(huì)被保留，其他RNA將被切割為小片段；用FastAP酶對(duì)保留下的RNA 3’端去磷酸化；c.在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入被生物素標(biāo)記過(guò)的胞嘧啶，它將與RNA的3’端結(jié)合，并使之標(biāo)記上生物素；d.用FastAP堿性酶去除RNA3’端上的磷酸基團(tuán)；加入T4多核苷酸激酶使得RNA的5’端加上磷酸基團(tuán)；此時(shí)，在非變性條件下，RNA的3’端與5’端則會(huì)發(fā)生鄰近連接，構(gòu)成新的RNA鏈，且該鏈的中間部分被生物素標(biāo)記；e.將細(xì)胞裂解并提取RNA，進(jìn)行片段化，富集含有生物素標(biāo)記的RNA短片段，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)f.利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，接著對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行下游生物信息學(xué)分析，最終可獲取細(xì)胞內(nèi)RNA互作信息。

RIC-seq技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先該方法獲取的RNA相互作用信息是真實(shí)存在于細(xì)胞內(nèi)部，相比PAIRS在體外進(jìn)行雙鏈RNA連接會(huì)產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性連接信號(hào)，RIC-seq具有更高的分辨率與準(zhǔn)確性，能捕捉到更多的RNA互作信息。但是該技術(shù)只能識(shí)別由RNA結(jié)合蛋白所介導(dǎo)的RNA-RNA相互作用，對(duì)于未與蛋白發(fā)生結(jié)合的RNA則并不能很好地檢測(cè)到信號(hào)。這也限制了RIC-seq對(duì)細(xì)胞中RNA互作信息的獲取范圍。

3 hiCLlP技術(shù)原理介紹

hiCLIP(RNA hybrid and individual-nucleotide resolution ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation)是一種檢測(cè)特定蛋白所結(jié)合的RNA間相互作用的分析技術(shù)。相比于前面兩種技術(shù)方法，hiCLIP所能得到的數(shù)據(jù)量較小，獲取的信息量有限，只能得到某一特定的雙鏈RNA結(jié)合蛋白上的RNA互作信息，但其實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，所受的化學(xué)試劑以及物理因素影響較小，能夠較為真實(shí)地反映細(xì)胞內(nèi)RNA互作狀態(tài)，對(duì)于需要關(guān)注某些特定蛋白上的RNA互作的研究者，該技術(shù)可能更為簡(jiǎn)便實(shí)用。

hiCLIP實(shí)驗(yàn)原理與CLIP實(shí)驗(yàn)基本相似，其具體實(shí)驗(yàn)流程如下：①將培養(yǎng)到一定密度的細(xì)胞用紫外光照射，使得RNA雙鏈與其結(jié)合的蛋白形成共價(jià)交聯(lián)；②加入去垢劑并將細(xì)胞破碎，獲取細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白形成的復(fù)合物；③得到的復(fù)合物用RNaseⅠ酶進(jìn)行RNA降解處理，使得未與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合的RNA片段全部降解；④利用特異性抗體，將雙鏈RNA結(jié)合蛋白與RNA分子形成的復(fù)合物進(jìn)行免疫沉淀，達(dá)到純化具有相互作用RNA片段的目的；⑤第一輪接頭連接，該步驟使用了A接頭與B接頭，接頭B能夠有效地將RNA雙鏈連接起來(lái)形成長(zhǎng)的單鏈，同時(shí)能保證連接反應(yīng)受內(nèi)源性連接酶的調(diào)控，在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，根據(jù)接頭B的位置也能更準(zhǔn)確地分辨出長(zhǎng)RNA序列中原來(lái)的兩條RNA雙鏈所在的位置。接頭A則包含逆轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)，保證RT-PCR的進(jìn)行。A，B接頭都連接在RNA雙鏈的3’末端。⑥第二輪接頭連接，利用B接頭將雙鏈RNA連接，進(jìn)行第二輪免疫沉淀，同時(shí)用SDS凝膠電泳分離純化復(fù)合物。從蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物中提取RNA。利用帶有UMI碼的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。⑦通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并將得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息分析，最終獲取細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的RNA互作信息。

4 結(jié)束語(yǔ)

上面三種技術(shù)都是典型RNA相互作用研究方法，但是這些技術(shù)卻有各自的特點(diǎn)。hiCLIP技術(shù)是基于特定的RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，該蛋白要求是RNA雙鏈結(jié)合蛋白，而且需要有該蛋白相應(yīng)的抗體才能進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，因此目前的應(yīng)用范圍十分狹窄，Staufen蛋白[7]是一種合適的RNA雙鏈結(jié)合蛋白，但其他的雙鏈結(jié)合蛋白靶標(biāo)RNA特征仍然需要進(jìn)一步研究，此外，該分析方法得到的數(shù)據(jù)絕大部分都是mRNA以及RNA分子內(nèi)的相互作用。hiCLIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程受到理化因素影響較小，能真實(shí)地反映出細(xì)胞內(nèi)的RNA互作情況，且相比于全轉(zhuǎn)錄組，大多數(shù)研究者更關(guān)注于某一特定蛋白上的RNA互作信息，實(shí)用性更強(qiáng)。PARIS方法需要有AMT以及365nm紫外光的幫助才能完成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作十分復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析難度大，且存在一定的假陽(yáng)性信號(hào)，但其得到的RNA相互作用數(shù)據(jù)是細(xì)胞內(nèi)整體的情況，不存在特異性，較為靈活方便。PARIS獲取的互作仍是以分子內(nèi)的RNA相互作用居多，但是分子間的RNA互作信息量相比hiCLIP有所提升，這有利于分析生物體內(nèi)的RNA-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。RIC-seq方法主要提取具有蛋白結(jié)合區(qū)域的RNA上的互作信息，其得到的互作信息準(zhǔn)確度較高，可以精確到單核苷酸分辨率，且實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)單，而且不依賴于堿基配對(duì)，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)更多的RNA互作信息起到關(guān)鍵作用，但對(duì)于未與蛋白發(fā)生結(jié)合的RNA互作信息，RIC-seq則無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。

討論基于高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組RNA相互作用研究技術(shù)仍在不斷發(fā)展，但是對(duì)于當(dāng)前方法的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，無(wú)論是數(shù)據(jù)量還是數(shù)據(jù)的類型，新技術(shù)與新技術(shù)之間仍存在著許多差異[8]。這可能提示我們，目前開發(fā)的技術(shù)所能檢測(cè)到的RNA相互作用都是細(xì)胞內(nèi)RNA互作信息的一部分，并不完全。因此我們可能需要將多種技術(shù)進(jìn)行融合，結(jié)合各個(gè)技術(shù)所獲取的分析數(shù)據(jù)，才能完整地構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)部RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，相同的實(shí)驗(yàn)方法多次檢測(cè)的結(jié)果之間也存在一定的差異，這也暗示了我們細(xì)胞中RNA相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，在不同時(shí)間，不同細(xì)胞類型所獲取的RNA互作信息亦存在差異。因此，想要整體地研究細(xì)胞內(nèi)RNA相互作用的分子機(jī)制，在目前看來(lái)仍然十分困難的，需要大量的投入和新的技術(shù)解決上述問(wèn)題。

RNA與RNA相互作用在生物體中十分重要，隨著這些高通量測(cè)序技術(shù)的開發(fā)，將會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越多的數(shù)據(jù)。我們也可以利用這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。依據(jù)RNA互作網(wǎng)絡(luò)，也有利于我們找到生物體中更加重要的靶標(biāo)RNA，用于下游研究分析。研究RNA相互作用，對(duì)于癌癥研究，藥物研發(fā)，家族遺傳病等，都會(huì)起到現(xiàn)實(shí)作用。