液體水溶性肥料中微生物活性保存技術(shù)

趙娜娜，李乃薈，陳 清，慕康國(guó)

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038）

液體水溶性肥料生產(chǎn)成本低、無(wú)污染，各養(yǎng)分混合均勻，質(zhì)量一致，肥效好，受到廣泛關(guān)注［1］。為了實(shí)現(xiàn)液體水溶性肥料的功能增值，與功能生防菌配伍生產(chǎn)功能性液體水溶性肥料是目前研究熱點(diǎn)。水溶性肥料養(yǎng)分含量高，影響了微生物菌體在液體肥料中的活性，使得微生物水溶肥尤其是養(yǎng)分含量較高的微生物液體水溶肥制備困難［2］。此外，因?yàn)樵谝后w環(huán)境中，當(dāng)溫度、溶解氧合適時(shí)芽孢類微生物會(huì)重新生長(zhǎng)，導(dǎo)致活性芽孢的數(shù)量減少，并且在肥料生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸過(guò)程中微生物易于死亡，嚴(yán)重影響了肥料的效果［3-4］。因此，微生物液體水溶肥穩(wěn)定性差，產(chǎn)品保質(zhì)期短。

針對(duì)微生物液體水溶肥中活菌數(shù)少、穩(wěn)定性差的問題，分析影響液體水溶性肥料微生物活性的因素，綜述目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)液體水溶性肥料中微生物活性保存技術(shù)，希望為延長(zhǎng)菌株在水溶性肥料中的存活時(shí)間提供理論參考。

1 液體水溶性肥料中微生物活性的影響因素分析

在液體水溶性肥料中微生物活性受多種因素的影響。當(dāng)生存環(huán)境適宜生長(zhǎng)時(shí)，微生物可以正常地進(jìn)行代謝、生長(zhǎng)、繁殖等活動(dòng)；當(dāng)環(huán)境不太適宜時(shí)，微生物的正常生命活動(dòng)受到抑制，活菌數(shù)量顯著減少。

微生物的生命活動(dòng)需要大量碳和氮營(yíng)養(yǎng)元素。碳源可以為細(xì)胞合成提供碳架，也能夠提供其進(jìn)行正常生命活動(dòng)所需能量，因此碳源是微生物生長(zhǎng)、分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)；微生物的原生質(zhì)主要是蛋白質(zhì)和核酸，大量的氮營(yíng)養(yǎng)元素則為其提供原料［5］。微生物菌體的生長(zhǎng)和代謝會(huì)受到液體水溶性肥料中n（C）/n（N）的影響，合適的n（C）/n（N）能夠?yàn)槲⑸餇I(yíng)造一個(gè)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，使其正常生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)n（C）/n（N）小于正常值時(shí)，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)盛，從而造成菌體的衰老自溶；當(dāng)n（C）/n（N）高于正常值時(shí)，會(huì)使菌體生長(zhǎng)偏少，導(dǎo)致發(fā)酵密度低于預(yù)期值，從而使細(xì)菌的代謝不平衡。但是只有合適的n（C）/n（N）也不夠，如果碳源和氮源的濃度過(guò)低，會(huì)影響菌體的正常繁殖；當(dāng)碳源和氮源的濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)影響菌體的發(fā)酵過(guò)程，使發(fā)酵液黏度增加，從而導(dǎo)致溶解氧降低，使菌體的代謝發(fā)生異常，進(jìn)而影響菌體的繁殖和最終產(chǎn)物的合成。

液體水溶性肥料一般鹽濃度較高，而過(guò)高的鹽濃度對(duì)微生物的菌體具有損害作用。鹽濃度會(huì)引起溶液滲透壓變化，當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)，外滲透壓升高，細(xì)菌內(nèi)水分大量流失，導(dǎo)致微生物脫水；而且微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程也會(huì)受到干擾或阻斷，導(dǎo)致微生物生命活動(dòng)受到抑制［6］。劉陽(yáng)等［7］通過(guò)基質(zhì)消耗速率、細(xì)胞生長(zhǎng)速率、相關(guān)代謝產(chǎn)物的生成表現(xiàn)鹽濃度對(duì)芽孢桿菌的影響，結(jié)果表明鹽濃度過(guò)高時(shí)，基質(zhì)中大部分葡萄糖用于代謝產(chǎn)物的合成，而不是菌體生長(zhǎng)。

液體水溶性肥料的pH 值會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞膜電荷的變化產(chǎn)生影響，從而抑制其對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用［8］。而且，微生物體內(nèi)的生化反應(yīng)均是在酶參與下進(jìn)行的，當(dāng)pH 值超出酶反應(yīng)的最適范圍時(shí)，會(huì)降低其轉(zhuǎn)化作用；過(guò)高的pH 值會(huì)使蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生水解，從而減少微生物數(shù)量［9］。相關(guān)研究表明，pH值在6 ～9時(shí)較適宜微生物生長(zhǎng)。

2 菌株活性保存

2.1 添加保護(hù)劑

為了避免液體水溶性肥料中的養(yǎng)分對(duì)微生物活性造成影響，可以選擇添加合適的保護(hù)劑提高微生物的存活率。保護(hù)劑一般分為小分子保護(hù)劑（如低聚糖類、緩沖鹽類、氨基酸、醇類及維生素類）和大分子保護(hù)劑（如蛋白質(zhì)、多肽類和多糖類）［10-11］。小分子保護(hù)劑可以通過(guò)氫鍵或離子基團(tuán)與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能保持完整。大分子保護(hù)劑在細(xì)胞表面形成了保護(hù)膜，從而阻止細(xì)胞受到損傷［12-13］。保護(hù)劑可以在微生物生存環(huán)境的pH 值、滲透壓、溫度發(fā)生變化時(shí)起到緩沖作用，從而保護(hù)菌體，避免損傷。因此，在微生物液體肥料中添加保護(hù)劑具有易于保存、保持微生物活性、延長(zhǎng)肥料貨架期等功效。

聚谷氨酸是指?jìng)?cè)鏈含有大量羧基基團(tuán)的一種特殊陰離子高分子聚合物，側(cè)鏈的基團(tuán)賦予其特殊的生物活性，作為一種黏附性物質(zhì)，聚谷氨酸可為生防菌提供莢膜保護(hù)，促使生防菌形成一種外在的包裹生物膜系統(tǒng)，由此隔斷生防菌細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，達(dá)到一種平衡穩(wěn)態(tài)，使其處于芽孢狀態(tài)［14］。馮小海等［15］提出了一種微生物液體菌劑及其制備方法，該微生物菌劑由促生菌菌液、聚谷氨酸和生物有機(jī)質(zhì)組成，生物有機(jī)質(zhì)包括生化黃腐酸、糖蜜和酵母提取物。聚谷氨酸和生物有機(jī)質(zhì)在其中起到相互促進(jìn)的作用，從而維持了液體菌劑中生防菌的活力，大大延長(zhǎng)了微生物液體菌劑的有效期，使菌劑中促生菌的活菌數(shù)量在18個(gè)月內(nèi)維持5×109CFU/mL。聚谷氨酸在微生物液體菌劑中為微生物提供莢膜保護(hù)，使其處于芽孢狀態(tài)。生物有機(jī)質(zhì)則可以在微生物液體菌劑處于包裝狀態(tài)時(shí)，通過(guò)提供高有機(jī)質(zhì)環(huán)境和高滲透壓環(huán)境抑制芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)，維持微生物液體菌劑中的促生菌處于芽孢狀態(tài)。而當(dāng)菌劑被稀釋后施用于農(nóng)作物時(shí)，生物有機(jī)質(zhì)濃度降低，隨即改變身份，成為芽孢萌發(fā)及微生物增殖的營(yíng)養(yǎng)成分，為促生菌芽孢萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)促生菌快速增殖。此外，生物有機(jī)質(zhì)還可以改善土壤結(jié)構(gòu)，緩解土壤板結(jié)，解決土壤酸化等問題。周振金等［16］發(fā)明了一種液體微生物菌肥，其中加入的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉和聚谷氨酸（γ-PGA）協(xié)同使用，一方面可以提高微生物的活性，延長(zhǎng)保存時(shí)間，另一方面還可以促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，提高植物自身的抗性。

海藻糖是一種白色晶體，屬于非還原性雙糖，由2個(gè)葡萄糖分子經(jīng)半縮醛羥基結(jié)合生成，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是安全的天然糖類。海藻糖可以強(qiáng)力地束縛水分子的運(yùn)動(dòng)，并與膜脂質(zhì)共同擁有結(jié)合水或直接代替膜結(jié)合水，因此可以防止生物體膜與膜蛋白的變性。海藻糖具有非還原性，可以存在于高溫、酸堿等環(huán)境中，因此它可在生物體內(nèi)起到脫水效果，于高鹽堿、寒冷、干旱等不適宜生存的條件下保護(hù)生物膜［17］。在液體水溶性肥料中添加一定量的海藻糖，可有效保持微生物性能，在保證有效微生物含量的前提下，大大延長(zhǎng)微生物液體菌劑的保存時(shí)間。GOPI 等比較了在液體肥料中分別添加2%甘油、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.015 mol/L海藻糖、1%甘油+1%PVP、甘油（2%）+海藻糖（1%）+酵母提取物（1%）+PVP（1%）+脯氨酸（1%）后的活菌數(shù)變化情況，研究結(jié)果表明，添加海藻糖（0.015 mol/L）的效果最好，18個(gè)月后活菌數(shù)保持較高數(shù)量［18］。

張保安等［19］在研發(fā)的微生物液體菌劑中添加保護(hù)劑，保護(hù)劑由對(duì)羥基苯甲酸、吐溫20、海藻糖和維生素C 組成。朱希坤等［20］將吐溫20、黃原膠和甘油組成的保護(hù)劑添加入液體菌劑中，在陰涼干燥處常溫保存，保存180 d時(shí)菌的存活率為57%，保存360 d 時(shí)菌的存活率為26%，保持在較高水平。HE 等［21］比較了添加膨潤(rùn)土、羧甲基纖維素鈉（CMC）、海藻酸鈉、聚乙烯醇后菌株的活性，研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比所有添加保護(hù)劑的處理都能維持活菌的數(shù)量，其中添加膨潤(rùn)土的活菌數(shù)最高。膨潤(rùn)土在完全水合后與水形成膠體，具有良好的吸附和固定細(xì)菌性能，因此對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用。

2.2 添加防腐劑

為了達(dá)到穩(wěn)定活菌數(shù)量的目的，還可以在液體肥料中添加山梨酸鉀、苯甲酸鈉等微生物防腐劑。這一類防腐劑可以抑制功能微生物的活性，但對(duì)菌體沒有殺滅作用［22］。防腐劑不僅可以抑制功能微生物的活性，減少養(yǎng)分的消耗，而且還可以為功能微生物的生長(zhǎng)繁殖提供所需能量，從而延長(zhǎng)菌液中微生物的存活時(shí)間，提高肥效。

鄧祖科等［23］研發(fā)的全營(yíng)養(yǎng)液體微生物肥，其中微生物防腐劑（丙三醇、麥芽低聚糖、海藻丙二醇脂、糖蜜、異麥芽低聚糖和苯甲酸鈉中的一種或多種）添加量為5%～10%，可以有效地延長(zhǎng)菌的存活時(shí)間。林斌等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在制備的微生物液體菌肥中添加乙酸可以使微生物液體菌肥在常溫下貯藏3個(gè)月內(nèi)菌的存活率基本保持穩(wěn)定，且用甲酸、檸檬酸替換乙酸可以收到同樣的效果。因此，在制備微生物液體菌肥時(shí)，添加有機(jī)酸對(duì)保持菌肥芽孢桿菌存活率、提高液體菌肥的貯藏穩(wěn)定性至關(guān)重要。

2.3 其他

劉文等［25］研發(fā)的一種保質(zhì)期長(zhǎng)的復(fù)合微生物液體菌劑，其特點(diǎn)在于復(fù)合微生物液體菌劑是好氧菌群與厭氧菌群復(fù)合而成的微生物液體菌劑，好氧菌及兼性好氧菌在好氧發(fā)酵階段進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，可在保證菌種純度和功能性的前提下，促進(jìn)好氧菌快速繁殖。好氧發(fā)酵完成后，液體好氧菌劑按比例混入?yún)捬醢l(fā)酵的菌劑中，好氧菌群受到厭氧菌群及弱酸條件的抑制，繁殖變得緩慢下來(lái)，多數(shù)菌株形成了芽孢，菌株活力得到保持并暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。而菌株養(yǎng)分與代謝能又得到了互補(bǔ)，菌群間形成了依存共生、互不拮抗的優(yōu)良共生環(huán)境。因此，該復(fù)合微生物液體菌劑保存有效期可以達(dá)到1年以上，稀釋后，菌株又能很快恢復(fù)生長(zhǎng)并發(fā)揮作用。

3 總結(jié)

為了提高微生物在液體水溶性肥料中的存活率，提高肥料的效果，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，采取一定的保存措施是必要的。添加防腐劑可以達(dá)到穩(wěn)定活菌數(shù)量的目的，但在田間運(yùn)用時(shí)，微生物常常表現(xiàn)出活性不夠。保護(hù)劑可以對(duì)環(huán)境的pH 值、滲透壓、溫度等變化起到緩沖作用，避免微生物生存環(huán)境條件的急劇變化，從而保護(hù)菌體，避免損傷，使微生物保持較高的存活率和活性。大量實(shí)驗(yàn)表明，液體水溶性肥料中加入保護(hù)劑可穩(wěn)定微生物的活性，不同的保護(hù)劑對(duì)微生物的保護(hù)效果不同，且單一的保護(hù)劑并不能滿足對(duì)微生物活性保存的要求，因此可以選擇將保護(hù)劑按一定配方混合使用。