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    利用干牛糞制備復合載體吸附微生物的研究

    2021-12-25 08:22:48武光宇楊明月
    中國乳業(yè) 2021年11期
    關鍵詞:鋸末麥麩硅藻土

    武光宇,楊 萌,楊明月,魯 琳*

    1 北京農(nóng)學院動物科學技術學院,北京 101300

    2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室,北京 102206

    0 引言

    固定化細胞技術是從20世紀70年代開始逐漸由固定化酶技術發(fā)展而來,利用物理或化學方法,使微生物細胞與固體的不溶性支持物,即載體相結合,從而可保持其方便儲存與運輸,又能保持其活性。 用此方法,酶無需從細胞被分離和純化,因此,酶的活性也只是輕微降低。微生物固定化技術因其細胞密度高、反應速度快、穩(wěn)定性好、抗毒害能力強、微生物損失小、產(chǎn)品容易分離、污泥含量低而被廣泛應用于廢棄物處理[1~4]。該項技術可高濃度選擇性地固定各種優(yōu)勢菌種,是近代工業(yè)微生物學上的重要革新,展示著廣闊的前景。

    最常用的微生物固定化載體可分為三類:無機載體、有機聚合物載體和復合載體。復合載體是一種結合了無機載體和有機載體的新型載體,兩類材料的特性相互補充,體現(xiàn)了復合載體的優(yōu)越性,有效地克服了生物固定化應用中遇到的問題,如形成的球粒容易碎裂和喪失活性,在降低成本和改善廢物管理方面有明顯的長處[5,6]。用作載體的硅藻土的主要成分是SiO2,已被證明可以穩(wěn)定活性成分,而且這種作用隨著K2O和Na2O含量的增加而增加。當硅藻土被酸處理后,氧化物含量減少,SiO2含量增加,比表面積和孔隙體積增加,使經(jīng)過處理的硅藻土成為比天然硅藻土更好的載體。

    近年來,關于固定化生物催化劑的研究發(fā)展迅速[7],并提出了一個基于共培養(yǎng)技術的新概念。共同培養(yǎng)方法通常使用具有相似培養(yǎng)條件的菌株,而這些菌株差異大,會使共同培養(yǎng)變得困難,但先以共同培養(yǎng)方法通過單獨培養(yǎng)菌株,然后將它們共固定起來的共固定技術克服了這些差異[8]。

    本試驗選擇了不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復合載體,研究了復合載體對微生物的吸附效果,旨在固化微生物時有相對固定的方法可尋,節(jié)約時間,提高效率。

    1 試驗材料與方法

    1.1 復合載體的吸水量測定

    在無菌條件下將菌液與各載體充分混勻,每次加入5 mL菌液,使載體濕潤,并保持疏松,不結塊。以菌劑所含的菌液量為載體吸水率,反映載體的吸附能力。

    1.2 復合載體吸菌后的條件優(yōu)化

    1.2.1 菌劑制作

    在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)液,將細菌ZX5、細菌ZH9、真菌ZZ9分別接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中。

    細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.00 g,蛋白胨5.00 g,氯化鈉5.00 g,蒸餾水1 000 mL,pH值為7.0~7.2。

    真菌的培養(yǎng)基為改良的高氏一號培養(yǎng)基:葡萄糖10.00 g,蛋白胨5.00 g,硝酸鉀1.00 g,氯化鈉0.50 g,磷酸氫二鉀0.50 g,硫酸鎂0.50 g,硫酸亞鐵0.01 g,蒸餾水1 000 ml,pH值為7.2~7.4。在25 ℃下靜置培養(yǎng)至對數(shù)期。

    1.2.2 載體制作

    稱量三角瓶子重量m1,分別稱量復合載體,選擇不同比例的麥麩、鋸末、干牛糞和硅藻土制備復合載體A、B、C,配比見表2-1。大約100 g于三角瓶中,于0.1 MPa,滅菌20 min后,放于烘箱中,在60 ℃下烘干48 h直到恒重,稱重為m2,由此得到載體凈重。按載體的吸水率,分別向載體中加入相應菌液量,分別放入30 ℃、40 ℃、50 ℃下儲存(表2、3)。分別在其第1、3、15、30天測定其纖維素酶酶活、脲酶酶活及過氧化氫酶酶活。

    表1 復合載體配比

    表2 復合載體接種不同菌種的樣本標號

    表3 復合載體接種不同菌種后在不同溫度下的樣本標號

    1.2.3 酶活測定

    (1)纖維素酶活性測定(硝基水楊酸比色法)

    葡萄糖標準溶液(1 mL標準液含0.2~0.8 mg葡萄糖)繪制:分別取不同濃度標準溶液1 mL移入25 mL容量瓶中,加3 mL二硝基水楊酸溶液。將試管放在沸騰水浴上5 min,然后迅速冷卻3 min,定容。15 min后在分光光度計上于波長540 nm處比色測定。以光密度值為縱坐標,以葡萄糖濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

    操作步驟:稱1 g菌劑于50 mL三角瓶中,加20 mL 1%羧甲基纖維素溶液、5 mL pH值為5.5磷酸鹽緩沖液及1.5 mL甲苯,將三角瓶放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束后,過濾并定容25 mL。取1 mL濾液,然后按照繪制標準曲線顯色法比色測定。纖維素酶活,以72 h,10 g土壤生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

    (2)脲酶活性測定

    標準溶液的繪制:精確的稱量0.471 7 g硫酸銨在水中,稀釋到1 000 mL,進而獲得1 mL含有0.1 mg氮的標準溶液。該溶液可以再作稀釋處理,稀釋倍數(shù)為10。將1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、11 mL、13 mL稀釋后的標準溶液移入50 mL容量瓶中,并加入20 mL蒸餾水,繼續(xù)加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氨酸鈉溶液,邊加邊搖,使其充分混合,20 min后,溶液顏色穩(wěn)定,定容。用分光光度計在578 nm處進行色譜分析,此操作在1 h內(nèi)進行,以光密度值和溶液濃度為依據(jù)繪制標準曲線。

    操作步驟:取1.00 g菌劑置于50 mL三角瓶中,加1 mL甲苯。15 min后加入10 mL10.0%尿素液和20 mLpH值為6.7的檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。過濾后取3 mL濾液注入50 mL容量瓶中,然后按繪制標準曲線顯色方法進行比色測定。脲酶活性以24 h后1.00 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。

    (3)過氧化氫酶活性測定

    取1.00 g菌劑置于100 mL三角瓶中,并注入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%過氧化氫溶液。將三角瓶放在往復式振蕩機上,振蕩20 min。而后加入5 mL 的0.6 mol/L硫酸,以穩(wěn)定未分解的過氧化氫,再將瓶懸液用慢速型濾紙過濾。然后,吸取25 mL濾液,和0.02 mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點。過氧化氫酶活性以20 min后1.00 g土壤的0.02 mol/L高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。

    2 試驗結果

    根據(jù)單載體的優(yōu)化試驗,選出幾個表現(xiàn)較好的載體:麥麩,鋸末,干牛糞和硅藻土。將這幾種載體按照一定比例配成復合載體,進行進一步的優(yōu)化試驗。

    2.1 復合載體的吸水率

    復合載體的吸水率見表4。

    表4 復合載體的吸水率

    2.2 復合載體吸菌后的優(yōu)化條件

    從圖1可以看出, ZH9過氧化氫酶活性測定中,24號的表現(xiàn)最為突出,各樣本除23、24號在培養(yǎng)第30天左右出現(xiàn)峰值,其余普遍在培養(yǎng)第3天時出現(xiàn)峰值。而從其纖維素酶活性的測定(圖2)可以知道各樣本的酶活相差不大,但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大,在培養(yǎng)第15天的時候出現(xiàn)峰值。其脲酶活性普遍偏低(圖3),而且各樣本出現(xiàn)峰值的時間沒有規(guī)律可言,但考慮到固定化菌劑的儲存問題,只有24號在培養(yǎng)第30天左右出現(xiàn)峰值。由此可見,24號樣本為固定ZH9菌劑的最優(yōu)條件。24號:復合載體B(麥麩25.0%,鋸末25.0%,干牛糞20.0%,硅藻土30.0%),儲存溫度:40 ℃。

    圖1ZH9菌過氧化氫酶活性

    圖2ZH9菌纖維素酶活性

    圖3ZH9菌脲酶活性

    圖4ZZ9過氧化氫酶活性

    從圖4可以看出,ZZ9過氧化氫酶活性測定中,10、11、12號的表現(xiàn)均較為突出,但3 個樣本的過氧化氫酶活性出現(xiàn)峰值的時間卻有些差異,10號在培養(yǎng)到第30天左右出現(xiàn)峰值,而11、12號則是在培養(yǎng)到第15天左右出現(xiàn)峰值,且11號>12號。而從其纖維素酶活性的測定(圖5)可以看出,各樣本的酶活相差不大,但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大,在培養(yǎng)第15天的時候出現(xiàn)峰值。其脲酶活性普遍偏低(圖6),而且各樣本出現(xiàn)峰值的時間大部分在培養(yǎng)第3天左右出現(xiàn)峰值,而10號樣本在各個階段的脲酶活性較其他樣本均偏高。綜上所述,10號樣本為固定ZZ9菌劑的最優(yōu)條件。10號:復合載體A(麥麩50.0%,鋸末10.0%,干牛糞20.0%,硅藻土20.0%),儲存溫度:30 ℃。

    從圖7可以看出,ZX5過氧化氫酶活性普遍較低,1、5號的表現(xiàn)均較為突出,但這兩者的過氧化氫酶活性出現(xiàn)峰值的時間卻有些差異,15號在培養(yǎng)到第15天左右出現(xiàn)峰值,而1號則是在培養(yǎng)到第1天左右出現(xiàn)峰值,而從其纖維素酶活性的測定(圖8)可以知道各樣本的酶活相差不大,但纖維素酶的活性隨著時間的增加而增大,在培養(yǎng)第15天的時候出現(xiàn)峰值,其脲酶活性普遍偏低(圖9),而且各樣本出現(xiàn)峰值的時間大部分在培養(yǎng)第3天左右出現(xiàn)峰值,而5號樣本在各個階段的脲酶活性較其他樣本普遍偏高。綜上所述,5號樣本為固定ZX5菌劑的最優(yōu)條件。5號:復合載體C(麥麩35.0%,鋸末35.0%,干牛糞20.0%,硅藻土10.0%),儲存溫度:40 ℃。

    圖5ZZ9菌纖維素酶活性

    圖6ZZ9菌脲酶活性

    圖7ZX5菌過氧化氫酶活性

    圖8ZX5菌纖維素酶的活性

    圖9ZX5菌脲酶的活性

    3 結論

    研究表明,細菌ZX5及ZH9的儲存溫度均在40 ℃時為最佳,但ZX5的最適復合載體為C,而ZH9的最適復合載體為B,復合載體C的麥麩、鋸末量均高于復合載體B,而硅藻土含量卻遠小于復合載體B,麥麩、鋸末的透氣性及養(yǎng)分含量要遠高于硅藻土,由此可見,ZX5對氧氣及養(yǎng)分的需求要高于ZH9;而真菌ZZ9的最適儲存溫度為30 ℃,最佳復合載體為A,其麥麩的含量占到50%,說明ZZ9對于養(yǎng)分需求較高。

    綜上所述,即使使用相同的底物和載體單位數(shù)量,不同的固定化方法將導致細菌與載體結合的模式和水平不同,而且沒有適用于所有類型微生物的通用固定化方法。這意味著微生物細胞的固定化是具特異性的。

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