MRI引導(dǎo)下氬氦靶向冷凍消融后兔坐骨神經(jīng)組織學(xué)改變

亓貞力，孫冠星，曹倩倩，包守剛，柳 明，李儲(chǔ)濤，李成利*

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬棗莊市立醫(yī)院腫瘤科，山東 棗莊 277102；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤科，山東 濟(jì)南 250033；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院影像介入治療科，山東 濟(jì)南 250021；4.山東師范大學(xué)體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000)

影像學(xué)引導(dǎo)下氬氦靶向冷凍消融術(shù)現(xiàn)已廣泛用于臨床治療實(shí)體腫瘤，并取得了良好療效[1-2]。臨床上，冷凍消融用于周圍神經(jīng)的主要目的在于通過冷凍致神經(jīng)毀損，以起到止痛作用，但目前對(duì)于氬氦靶向冷凍消融治療侵犯周圍神經(jīng)的腫瘤時(shí)對(duì)周圍神經(jīng)的損傷程度以及損傷后神經(jīng)恢復(fù)等研究較少。本研究通過對(duì)兔坐骨神經(jīng)行MRI引導(dǎo)下氬氦靶向冷凍消融，觀察不同冷凍條件下以及冷凍后不同時(shí)期坐骨神經(jīng)組織學(xué)改變，以評(píng)價(jià)氬氦靶向冷凍消融對(duì)兔坐骨神經(jīng)的影響，旨在為臨床應(yīng)用氬氦靶向冷凍消融治療侵犯周圍神經(jīng)腫瘤的安全性和可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年新西蘭大白兔20只，雌雄不限，體質(zhì)量3.4～4.0 kg，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院畜牧所，合格證號(hào)：SCXK(魯)2009-0013。將兔隨機(jī)分為A、B組，每組10只，均以左側(cè)坐骨神經(jīng)為消融側(cè)、右側(cè)為對(duì)照側(cè)。

1.2 主要儀器 采用Marconi 0.23T常導(dǎo)開放式MR儀，Ipath200光學(xué)導(dǎo)航系統(tǒng)，小號(hào)柔性多功能線圈；GE Signa HDx 3.0T超導(dǎo)MR儀，多功能柔性線圈；CRYO-HITTM氬氦冷凍消融系統(tǒng)及MR兼容性1.47 mm氬氦靶向冷凍探針(Galil Medical Ltd)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 術(shù)前掃描 采用GE Signa HDx 3.0T超導(dǎo)MR儀。麻醉實(shí)驗(yàn)兔后，將其仰臥位保定于多功能柔性線圈內(nèi)，采集快速自旋回波(fast spin echo， FSE)序列T1WI(TR 400 ms，TE 7.2 ms，F(xiàn)A 90°，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，層厚3 mm，層間隔0.5 mm，矩陣320×224，TA 1 min 35 s)和T2WI(TR 2780 ms，TE 104 ms，F(xiàn)A 90°，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，層厚3 mm，層間隔0.5 mm，矩陣320×224，TA 2 min 48 s)，于斜冠狀位圖像中以股骨粗隆為標(biāo)志點(diǎn)確定靶神經(jīng)。

1.3.2 氬氦靶向冷凍消融 采用Marconi 0.23T常導(dǎo)開放式MR儀。將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位保定于小號(hào)柔性線圈內(nèi)，采集場(chǎng)回波(field echo， FE)-T1WI(TR 430 ms，TE 16 ms，F(xiàn)A 60°，F(xiàn)OV 300 mm×300 mm，層厚8 mm，矩陣256×256，TA 18 s)和完全平衡穩(wěn)態(tài)(complete balanced steady state， CBASS)序列圖像(TR 8.4 ms，TE 4.2 ms，F(xiàn)A 45°，F(xiàn)OV 300 mm×300 mm，層厚5 mm，矩陣256×256，TA 28 s)，于斜冠狀位及軸位圖像中確定靶神經(jīng)位置，并確認(rèn)靶點(diǎn)，使A組坐骨神經(jīng)位于消融區(qū)中心、B組位于消融區(qū)邊緣距靶神經(jīng)約10 mm。常規(guī)局部麻醉后，在Ipath200系統(tǒng)引導(dǎo)下將冷凍探針準(zhǔn)確穿刺至靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 術(shù)中MRI A.定位坐骨神經(jīng)位置(紅點(diǎn))； B.消融探針形成的冰球表現(xiàn)為橢圓形信號(hào)缺失區(qū)(箭) 圖2 術(shù)后3.0T MR T2WI確定靶神經(jīng)與冷凍消融區(qū)位置關(guān)系，坐骨神經(jīng)表現(xiàn)為線狀稍低信號(hào)(藍(lán)箭)，消融區(qū)為略高混雜信號(hào)(紅箭)

之后啟動(dòng)氬氦冷凍消融系統(tǒng)，氬氣壓力3 600 Pa，冷凍12 min，氦氣壓力2 000 Pa，升溫1 min，重復(fù)升溫3次為1個(gè)循環(huán)，共行2個(gè)循環(huán)冷凍消融。術(shù)中間隔1.5 min行連續(xù)MR掃描，觀察冰球形成情況，確保A組靶神經(jīng)位于氬氦冷凍冰球中心(冷凍溫度可達(dá)-100℃以下)、B組靶神經(jīng)鄰近冰球邊緣約10 mm(冷凍溫度約-40℃)。對(duì)對(duì)照側(cè)僅行冷凍探針穿刺。

1.3.3 驗(yàn)證 冷凍消融后立即以GE Signa HDx 3.0T超導(dǎo)MR儀進(jìn)行掃描，確定靶神經(jīng)與冷凍區(qū)域的位置關(guān)系(圖2)；發(fā)現(xiàn)不符合要求者予以剔除，并補(bǔ)充動(dòng)物重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo) 分別于術(shù)后即刻、7、14、30和60天處死A、B組各2只兔，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察其組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)兔均穿刺并施行冷凍消融成功。

2.1 消融側(cè)(左側(cè))坐骨神經(jīng)組織學(xué)表現(xiàn) A組坐骨神經(jīng)冷凍后即刻見神經(jīng)纖維內(nèi)血管明顯擴(kuò)張充血；軸索腫脹，著色變淺，邊界不清，髓鞘疏松；束膜疏松。術(shù)后7天軸索消失，髓鞘松散或消失，鞘管呈空泡樣，少部分神經(jīng)纖維內(nèi)可見軸索存在，髓鞘松散淺染；神經(jīng)束膜增厚、疏松。術(shù)后14天神經(jīng)周邊血管和間質(zhì)明顯增生；幾乎全部神經(jīng)纖維均形成鞘管，排列紊亂，部分髓鞘凝集、深染。術(shù)后30天神經(jīng)鞘管間可見少量再生軸索及施萬細(xì)胞；神經(jīng)束膜較前致密。術(shù)后60天鞘管間見大量間質(zhì)組織增生，伴部分再生軸索及施萬細(xì)胞。見圖3。

圖3 A組消融側(cè)坐骨神經(jīng)病理圖(HE，×400) A.術(shù)后即刻血管擴(kuò)張充血，軸索淺染，髓鞘疏松，束膜疏松； B.術(shù)后7天神經(jīng)軸索消失，髓鞘松散，鞘管呈空泡樣； C、D.分別為術(shù)后14(C)及30天(D)，神經(jīng)周邊見血管及間質(zhì)增生，幾乎全部纖維形成鞘管； E.術(shù)后60天，鞘管間見大量間質(zhì)組織增生，伴再生軸索及施萬細(xì)胞

B組坐骨神經(jīng)冷凍后即刻取材可見神經(jīng)內(nèi)血管擴(kuò)張淤血；髓鞘疏松、著色較淺，軸索增粗，著色變淺；神經(jīng)束膜疏松。術(shù)后7天部分神經(jīng)纖維退行性變形為鞘管，軸索消失。術(shù)后14天，擴(kuò)張的血管消失；鞘管間見再生軸索及施萬細(xì)胞；神經(jīng)束膜恢復(fù)致密表現(xiàn)。術(shù)后30天鞘管數(shù)量較前減少，可見大量再生軸索及施萬細(xì)胞。術(shù)后60天再生軸索、施萬細(xì)胞密布，但尚未形成規(guī)整的有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)。見圖4。

圖4 B組消融側(cè)坐骨神經(jīng)病理圖(HE，×400) A.術(shù)后即刻血管擴(kuò)張，髓鞘疏松，束膜疏松； B.術(shù)后7天部分神經(jīng)纖維形成鞘管； C.術(shù)后14天見再生軸索，束膜致密； D.術(shù)后30天，鞘管數(shù)量減少，大量再生軸索； E.術(shù)后60天見再生軸索及施萬細(xì)胞密布，但未形成規(guī)整的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)

2.2 對(duì)照側(cè)(右側(cè))坐骨神經(jīng)組織學(xué)表現(xiàn) 各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維均排列整齊、致密、有序，軸索深染，位于中心，呈星狀；髓鞘染色均勻呈網(wǎng)狀；神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜致密深染，厚度均勻。見圖5。

圖5 對(duì)照側(cè)坐骨神經(jīng)病理圖(HE，×400) A、B.分別為術(shù)后即刻(A)及術(shù)后1周(B)，神經(jīng)纖維排列致密，軸索深染，髓鞘染色均勻，神經(jīng)外膜、束膜致密深染，厚度均勻一致

3 討論

2015年初，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將首個(gè)商用冷凍消融探針用于臨床消融周圍神經(jīng)[3]。此后越來越多冷凍消融周圍神經(jīng)以止痛的病例見諸報(bào)道[4-5]；其冷凍消融溫度多為-40～-60℃，冷凍時(shí)間約3～5 min[6]。

MRI引導(dǎo)下冷凍消融術(shù)是于開放式MRI導(dǎo)引下將MR兼容性氬氦冷凍探針作用于靶區(qū)，通過氬氣與氦氣快速降溫、升溫而使組織徹底破壞[7]。冷凍對(duì)組織造成損傷的機(jī)制包括直接損傷和微循環(huán)損傷[8]。直接細(xì)胞損傷指細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成和細(xì)胞內(nèi)高滲環(huán)境致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷和蛋白質(zhì)變性，在周圍神經(jīng)可致髓鞘和施萬細(xì)胞發(fā)生物理性損傷[9-10]。微循環(huán)損傷指滋養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷使血管通透性增加，致神經(jīng)纖維水腫，而復(fù)溫后再灌注致血小板聚集、黏附伴血栓形成，導(dǎo)致局部缺血，加重神經(jīng)損傷。有研究[11]認(rèn)為微循環(huán)損傷是周圍神經(jīng)冷凍損傷的主要原因。

既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[12-14]顯示，冷凍損傷周圍神經(jīng)主要受冷凍溫度與冷凍時(shí)間的雙重影響。冷凍溫度越低，周圍神經(jīng)損傷越重，神經(jīng)功能恢復(fù)時(shí)間越長；冷凍溫度為-5～0℃時(shí)，周圍神經(jīng)僅發(fā)生短暫性脫敏，形態(tài)無明顯改變；溫度降低至-20℃時(shí)，神經(jīng)纖維輕度水腫，但組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞；隨著溫度進(jìn)一步降低，周圍神經(jīng)會(huì)發(fā)生從退行性變到變性、壞死的不同程度損傷，修復(fù)時(shí)間也從30天(-60～-20℃)延長到60天(-100℃)；當(dāng)溫度低于-100℃時(shí)，經(jīng)過60天的修復(fù)，神經(jīng)結(jié)構(gòu)仍不能恢復(fù)完善[12]。相同溫度下，冷凍持續(xù)時(shí)間越長，周圍神經(jīng)損傷越重，恢復(fù)所需時(shí)間越長。MOORJANI等[13]采用CO2為冷媒，以-50℃冷凍家犬肋間神經(jīng)，觀察其組織學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)冷凍時(shí)間在1.0 min以內(nèi)時(shí)，神經(jīng)纖維發(fā)生變性，第3天即開始出現(xiàn)再生修復(fù)；冷凍時(shí)間為1.5 min及2.0 min時(shí)，神經(jīng)纖維出現(xiàn)變性、壞死，1周后開始修復(fù)再生，3個(gè)月后神經(jīng)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。左建新等[14]亦以CO2為冷媒，以-70℃冷凍犬肋間神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)冷凍30 s時(shí)肋間神經(jīng)結(jié)構(gòu)尚未破壞，10天后改變以變性為主；而隨冷凍時(shí)間延長，神經(jīng)纖維發(fā)生變性、斷裂，10天后改變均以壞死為主。

對(duì)于氬氦靶向冷凍消融對(duì)周圍神經(jīng)的影響是否與CO2等其他冷媒相同目前尚無定論。本實(shí)驗(yàn)以氬氦靶向冷凍消融兔坐骨神經(jīng)，觀察冷凍溫度及冷凍時(shí)間對(duì)神經(jīng)損傷的影響，A組消融時(shí)坐骨神經(jīng)處于冷凍區(qū)域中心，溫度達(dá)-100℃以下，冷凍時(shí)間約12 min，冷凍后即刻見神經(jīng)纖維明顯腫脹變性，14天時(shí)損傷發(fā)展至高峰，30天時(shí)出現(xiàn)修復(fù)，而60天時(shí)神經(jīng)仍可見修復(fù)表現(xiàn)；B組靶神經(jīng)位于冰球邊緣，冷凍溫度約-40℃，冰球約在開始冷凍后10 min覆蓋神經(jīng)，即神經(jīng)冷凍時(shí)間約為2 min，其神經(jīng)損傷明顯輕于A組，7天時(shí)已見神經(jīng)修復(fù)表現(xiàn)，60天時(shí)神經(jīng)已大部分修復(fù)。本研究A組坐骨神經(jīng)損傷程度較既往研究[13-14]報(bào)道更重，原因可能為A組冷凍時(shí)間為12 min，且進(jìn)行了2次冷融循環(huán)。

綜上，MRI引導(dǎo)下氬氦冷凍消融兔坐骨神經(jīng)后，所致神經(jīng)損傷在術(shù)后14天時(shí)達(dá)到高峰，隨后出現(xiàn)修復(fù)征象，但60天內(nèi)無法完全修復(fù)，當(dāng)神經(jīng)位于消融區(qū)中心時(shí)損傷更為嚴(yán)重。上述結(jié)果提示，臨床應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用氬氦冷凍消融治療包繞重要周圍神經(jīng)的腫瘤，尤其用于治療鄰近周圍神經(jīng)的腫瘤時(shí)，應(yīng)考慮到一定時(shí)間內(nèi)可能出現(xiàn)的神經(jīng)功能損傷。