表面等離激元共振成像技術在血型檢測中的研究進展*

吳曉聰，何建安，伍昌林，李華文，顧大勇

(1.廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣東東莞523808；2.深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳518033；3.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東深圳518010；4.深圳大學第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院 a.輸血科，b.檢驗科，廣東深圳518035)

輸血成功依賴于準確可靠的血液分型方法。目前有39個公認的血型系統(tǒng)，血型抗原超過300個，最廣為人知的血型系統(tǒng)是ABO和RhD系統(tǒng)。這300多個血型抗原中許多具有重大臨床意義，如果分型不正確會導致免疫介導的溶血性輸血反應(hemolytic transfusion reaction，HTR)。血清學法、微柱凝膠卡法和PCR-序列特異性引物(sequence specific primer，SSP)等技術檢測血型，或需要標記，或檢測周期長、檢測通量低，容易造成假陽性或假陰性。表面等離激元共振(surface plasmon resonance，SPR)技術被公認為是“最好的無標記生物檢測方法”。表面等離激元共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRi)技術與蛋白質芯片技術結合，可以發(fā)揮二者的優(yōu)點，是一種全新的、精準的檢測血型的免疫學診斷技術。

1 常用血型檢測方法

1.1免疫學法 玻片凝集法、試管凝集法、微量平板凝集法和凝膠柱凝集法[1-3]鑒定血型在檢測過程中容易受多種因素影響，結果判讀極易出錯，其操作難以實現(xiàn)規(guī)范化。目前，流行的量化方法是通過視覺對抗原抗體結合強度進行初步分類，但由技術人員進行分析量化的方法是主觀的、經驗的、欠敏感的，且通過簡單的視覺分析來辨識弱交互作用通常很難。熒光輔助細胞分選技術(FACS)和流式細胞術(FCM)是2種可以定量分析紅細胞抗原與其相應抗體相互作用的方法。但是這2種方法都需要雙鍵和單鍵交替的分子結構產生共軛效應來激發(fā)熒光效果，會影響抗原抗體結合的活性。FACS使用帶有標記的抗體，這種抗體發(fā)出明亮的熒光，可在特定波長下用光學顯微鏡觀察。同樣，F(xiàn)CM依賴于附在血細胞上的熒光標記抗體，測量細胞通過激光時發(fā)出的光[4-5]。這些方法通常用于量化紅細胞表面表達的抗原位點的數(shù)量，并具有動力學分析能力。然而，由于抗體抗原復合物在用FACS或者FCM檢測熒光之前發(fā)生反應，這2種方法都受到時間延遲分析的影響。因此，實時測量抗原抗體相互作用分析有限。

1.2基因分型檢測 目前使用的ABO血型基因分型技術可以分為2大類：檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)和檢測核苷酸序列。檢測SNP的技術包括：用SSP擴增SNP片段的PCR-SSP技術，通過PCR擴增產物與序列特異性寡核苷酸探針(sequence specific oligonucleotide probes，SSOP)雜交來鑒定相應SNP片段的PCR-SSOP技術[6]。PCR-SSP和PCR-SSOP技術只能檢測出已知的SNP，因此可能漏檢未知的基因突變，這是該技術的先天性缺陷。此外，除非鑒定全部數(shù)以百計的已知SNP，否則可能得到錯誤的基因分型結果。在以PCR為基礎的測序分型技術(sequence based typing，SBT)中，PCR擴增產物一般含有2條單體型DNA，觀察到的測序圖是2條單體型核苷酸序列的加合，因此可能產生模棱兩可的分型結果。

分子克隆技術是將ABO血型基因克隆到載體后再測序，這樣每個克隆只含有1條單體型的基因片段，不存在模棱兩可的測序結果，但是整個過程比較費時費力，因此一般只用于驗證新發(fā)現(xiàn)的等位基因。

眾所周知，檢測出某個基因或其mRNA不能作為該基因所編碼的蛋白質得到表達的直接指標?；蚍中皖A測的血型表型，最終必須用血清學方法驗證，以避免潛在的定型錯誤。雖然血型基因分型技術已廣泛應用于ABO血型基因分型，但是由于產生ABO亞型分子機制的多樣性，基因分型預測ABO亞型尚有一定的局限性。

1.3新型傳感器 SPR生物傳感器主要由光學檢測系統(tǒng)、傳感芯片、液流控制系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)和計算機軟件5部分元件組成。其中，傳感芯片是最核心的組件，傳感芯片提供了產生SPR信號的必需物理條件，且分子相互作用在傳感芯片表面進行[7]。根據(jù)光學反射率變化的原理，SPR生物傳感器中生物分子在金(Au)表面吸附，導致活性金表面附近折射率發(fā)生變化，根據(jù)折射率的信號變化觀察生物分子的相互作用，通過監(jiān)測結合和解離過程中光學性質的變化來研究分析動力學、親和力和濃度的定性及定量信息[8-9]。大多數(shù)細胞不適用于商用SPR儀器的微流控系統(tǒng)，而紅細胞具有高度變形性，適用于微流控系統(tǒng)。SPR技術可針對血液免疫學檢測需求，將具有高靈敏度優(yōu)點的SPRi技術與微流控芯片技術集成，發(fā)展成為滿足臨床需求的血液免疫分析儀。

2 SPR在血型鑒定中的應用研究

2.1ABO+RhD血型鑒定 血型鑒定可利用SPR技術在傳感器表面固定相應的血型抗原或抗體進行檢測。Quinn等[10]首次報道了SPR在血型抗原和抗體中的應用，利用相應的血型IgM抗體修飾SPR傳感器表面，實現(xiàn)對紅細胞表面A、B抗原的檢測。雖然該方法對A、B抗原均有較好的選擇性，但由于不能完全解離結合材料或部分功能化表面被祛除導致表面再生能力較差。近年來，人們對SPR技術應用于血型檢測進行了大量研究，使傳感器表面再生得到了改善，并且增加了測量周期的次數(shù)，提高了該方法的可行性。Hungkamang等[11]使用微陣列傳感器芯片固定抗A和抗B，觀察抗體陣列與紅細胞表面A、B抗原之間的相互作用來對ABO血型進行鑒定。他們使用SPRi進行多重分析，降低了檢測成本、檢測時間和樣品消耗。將SPR應用于血液分型中，還需要充分了解抗原抗體凝集強度的附加信息。依據(jù)粘附強度和壁面剪應力(WSS)，粘附的紅細胞在剪切流條件下會以不同的細胞平均速度(Vc)被迫離開感興趣區(qū)域。根據(jù)紅細胞膜上攜帶的抗原與抗體的相互作用對細胞運動的抵抗力，細胞平均速度(Vc)越高，凝集強度越低，相應的抗原-抗體結合程度越低，否則相反。根據(jù)SPR信號隨時間的變化來計算Vc的凝集強度，可用于不同凝集素的定量分析[11]。Sudprasert等[12]利用固定化抗A、抗B抗體陣列與紅細胞膜表面抗原的相互作用，獲得了紅細胞與固定化抗體的凝集強度，其凝集強度與抗原-抗體相互作用的量或紅細胞粘附強度相對應。Tangkawsakul等[13]利用抗A和抗B共價固定在由高折射率玻璃、Cytop膜層和金薄膜(Au)組成的LR-SPR生物傳感器芯片上來大量檢測分析物質，即紅細胞。研究表明，LR-SPR芯片與常規(guī)短程SPR傳感器相比，靈敏度更高、表面再生效果更佳。結合微陣列技術，SPRi技術可發(fā)展成為高通量和多重分析的有效工具。

在驗血的時候，抗體有2種類型：(1)五聚IgM，(2)單抗IgG。根據(jù)血凝原理，紅細胞表面抗原與血型特異性IgM抗體發(fā)生結合，便于紅細胞凝集和陽性鑒定。但是與IgM抗體不同的是，IgG抗體與紅細胞結合時不出現(xiàn)凝集，需要使用額外的凝集試劑抗人IgG做陽性指示，即用IgG抗體對陽性紅細胞進行致敏化，抗人IgG就能檢測到致敏紅細胞上的球蛋白分子Fc片段，從而檢測抗原是否存在，這被稱為間接抗球蛋白試驗(IAT)[5]。Krupin等[14]使用了長程表面等離子體激元波導，通過固定的抗A IgG抗體捕獲紅細胞上血型抗原A，檢測紅細胞表面抗原A和B。該系統(tǒng)允許在極低的細胞濃度樣品中捕獲紅細胞，捕獲檢測濃度遠遠低于觀察到的最低血細胞比容水平的濃度。Li等[15]構建了在玻璃襯底上沉積納米金(GNPs)表面固定抗A和抗B的光學生物傳感器，該傳感器進一步集成到含有2個獨立樣本細胞的微流控芯片中，與紫外可見光譜儀相結合，分別用于A、B、AB和O型血液的鑒定，建立了一種簡便、快速、可靠的ABO血型分型和紅細胞計數(shù)檢測方法。該方法用于血液分型具有較高的準確性，用于紅細胞計數(shù)具有較高的敏感性。與傳統(tǒng)方法相比，該傳感器能夠同時進行血型分型和紅細胞計數(shù)，有利于快速評價貧血[16-17]。與普通凝膠微柱測定相比，該測定方法更靈敏，需要的血液樣品較少、時間更短。因此，該檢測平臺有潛力對血型系統(tǒng)進行定性和定量檢測，修飾其他常見紅細胞表面抗原的抗體，如Rh因子。此外，該傳感器有望實現(xiàn)全自動，從而達到省時、避免人為誤差的目的。

為了實現(xiàn)高效的基于SPR血液分型，需要一種更快速、更方便的抗體定向固定方法。經典的右旋糖酐-水凝膠偶聯(lián)方法具有非特異性結合低、結合能力高、化學穩(wěn)定性強等優(yōu)點。然而，這種方法既繁瑣又耗時(2～3 d)，還需要技能熟練的操作員。而且固定的方法導致隨機抗體固定，因為空間位阻可能會影響抗體與抗原的結合能力。Zhou等[18]提出了一種新的方法來量化ABO血型，開發(fā)了一種基于波長干涉的SPRi傳感器，采用抗體結合蛋白修飾的SPR芯片直接固定血型抗體，形成檢測線陣列，當血樣與抗A和抗B相互作用時，通過共振傾角的變化同時檢測4個紅細胞樣本。血液分型結果與微柱凝膠試驗結果一致，檢測時間包括芯片修改時間均小于1 h。該方法對紅細胞A和B的檢測量最低為每毫升2×106個細胞，比傳統(tǒng)的SPR血型傳感器具有更高的靈敏度。在緊急和資源限制的情況下，這種技術在快速診斷、移動保健和公共衛(wèi)生安全領域有著巨大的應用潛力。

Rh(D)抗原表型除了正常的D陽性和陰性表型外，還有多種D變異表型，如弱D、部分D和DEL型。Then 等[19]以D抗原為例探討了一種用通用的抗人IgG抗體來檢測紅細胞抗原的方法。該方法借鑒了間接抗球蛋白試驗(IAT)，使用抗人IgG抗體與致敏紅細胞量化出紅細胞與抗體(IgG)之間的相互作用，從而進行血型分型檢測。該檢測表面可完全再生，在進行100多次再生過程中，功能化表面幾乎沒有降解。他們也探討了SPR定量檢測血液中的弱抗原和部分抗原的潛力和敏感性[20]。該敏感性研究將抗人IgG抗體固定在金傳感器表面，然后使用SPR檢測兩種臨床上重要類型的弱D變體：弱D和部分D。相較于以往的研究，利用SPR實現(xiàn)了兩類弱D變體的檢測，提高了靈敏度，為血型抗體-抗原相互作用的識別、定量和分類開辟了巨大的新前景。

2.2Rh抗原及Duffy抗原檢測 Rh 血型系統(tǒng)是目前被國際輸血協(xié)會(ISBT)確認的30多個紅細胞血型系統(tǒng)中最具復雜性和多態(tài)性的血型系統(tǒng)，在臨床輸血中其重要性僅次于 ABO 血型。Rh血型抗原除了D抗原具有很強的免疫原性外，C、c、E 和e抗原在輸血過程中也會引起溶血性輸血反應以及新生兒溶血癥。Rh系統(tǒng)主要多態(tài)性為C/c、E/e。因此，設計抗C，抗c，抗E，抗e的單克隆抗體，可以構建SPR檢測芯片來分析Rh血型抗原表型種類進行血型檢測。Szittner等[21]展示了一個和臨床相關的血型抗體(A，B和Rh血型)組成的SPR陣列，只需少量的血液樣品處理，每個血樣本能夠在5 min內進行快速的血型表型分析，這為大量供輸血的樣本處理提供一種可行的替代經典血型分型的方法。對照現(xiàn)有實驗室診斷的標準技術，在cspri-rbc芯片上配備8種主要血型抗體中的7種(A、B、D、C、c、E和K)，可對隨機供體樣本進行重復分型，并且其分型以及再生能力都非常強，特異性抗體分型的數(shù)量至少可以增加到96種，還有至少可以對100個樣本進行分型。除抗E/e單克隆抗體以及抗體特異性低會導致結果不一致外，所有抗體的分型結果與經典血清學結果完全一致。該研究表明SPRi的傳感器表面可以固定多種RBC抗體，并且重復多次使用還能獲得所有樣本可靠的分型。但由于Rh血型系統(tǒng)抗原類型與A和B抗原在RBC上位置的差異，Rh抗原需要更長的溫育時間來與固定的抗體反應，并且停止流動試驗可以促進Rh抗原、跨膜蛋白和固定抗體之間的相互作用，而連續(xù)流動不能應用于檢測分析。Pipatpanukul等[22]證實了這項技術的適用性，即AB和Rh血型特異性抗體可直接固定在傳感器羥甲基葡聚糖(CMD)改性的金表面上進行紅細胞表面抗原的檢測。該研究通過固相固定試驗同時識別抗原，顯示了檢測Rh稀有血型系統(tǒng)的潛力，減少了手工操作的時間，簡化分析，提高了成本效率。

眾所周知，Duffy系統(tǒng)抗體-抗原之間的相互作用在血液系統(tǒng)中是比較弱的，與RhD血型相比，Duffy血型表達的抗原相對較少，并且具有完全不同的結構。目前定量檢測Fya和Fyb抗原的方法并不十分敏感，這在分析弱的Fya和Fyb抗原抗體相互作用時受到了嚴重的限制。Then等[23]以Duffy血型(Fya和Fyb)作為模型探討了SPR技術在血液分型中檢測弱抗原抗體相互作用的價值，研究了一種抗人IgG Fc功能化傳感器表面來檢測Duffy抗原弱的相互作用。該研究表明抗體濃度的最低閾值是成功檢測的必要條件。在孵育階段使用濃縮的抗Fya和抗Fyb液，部分檢測成功。但是這些結果并不完全可復制，隨著時間的推移，Duffy抗原-抗體復合物發(fā)生了顯著的離解，而且影響SPR檢測Duffy抗原的因素有多種，包括抗體濃度、抗原表達和抗原結構。這些弱、不穩(wěn)定和可逆的抗體-抗原相互作用限制了SPR檢測的準確性和重復性。盡管存在這些障礙，但使用SPR技術成功檢測了陽性Duffy抗原。RBC結合檢測的實例表明，一旦能形成更強、更穩(wěn)定的抗原-抗體復合物，就可以進行SPR分析和檢測。

2.3血小板抗體的篩查 輸注血小板可預防和治療血小板減少或血小板功能缺陷引起的出血，但是患者多次輸血后，容易產生血小板相關抗體，導致血小板輸注無效(PTR)[24]。血小板特異性抗體的檢測對血小板免疫性疾病的診斷具有重要意義。目前，血小板抗體檢測和鑒定的方法，主要是固相凝集法、單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(MAIPA)和FCM等。MAIPA、固相凝集法的指示紅細胞的保存期短，易造成試劑浪費等；免疫法易出現(xiàn)假陰性或假陽性，該方法進行臨床檢測時需要較多混合的O型血小板，但血小板表面抗原的復雜性，抗原譜不明確，易造成抗體的漏檢。因此，需要進一步改進研究或采用新的檢測方法。Metzner等[25]報道了一種新開發(fā)的、易于操作的血小板抗體珠陣列(PABA)，用于檢測血小板特異性抗體的性能。PABA是一種將MACE技術與珠陣列技術相結合的檢測人血小板抗體的可靠的多重檢測平臺。該平臺將促進實際鑒定血小板特異性抗體的常規(guī)檢測。伍昌林等[26]初步應用SPR的非標記技術在血小板抗體的篩選與配型中，他們采用氨基耦聯(lián)法在SPR傳感芯片表面固定相應的通用型血小板抗原，實現(xiàn)了對相應血小板抗體的檢測。但是，SPR技術是使用血小板譜抗原作為點樣抗原，由于抗原譜的復雜性，可能存在抗原譜不全面，從而出現(xiàn)血小板稀有抗體漏檢的問題。隨著基因組學與蛋白組學的發(fā)展，血小板抗原的全面檢測，該問題將會解決。隨著SPR技術進一步發(fā)展成熟，臨床應用將更加簡便，可以直接篩查血小板抗體，通過配合試驗，選擇與受血者相合的血小板顯得更加容易，該技術將有望應用于臨床日常檢測工作中。

3 總結與展望

SPR是一種無標記的實時跟蹤分子相互作用的方法，利用固定在傳感器表面上的IgM或抗人IgG的特異性紅細胞抗體或血小板血型抗原來實現(xiàn)基于SPR的血液分型與鑒定，所述抗體或者抗原又用作捕獲血液分析物的配體，通過SPRi技術監(jiān)測微流控室中結合的分析物實現(xiàn)對ABO和RhD血型鑒定，Rh抗原及Duffy抗原檢測以及血小板抗體的篩查，從而進行血型鑒定以及分型，并且可以循環(huán)再生使用。新型號的SPR生物傳感器還可以實現(xiàn)自動化，可以同時分析多個樣本，為定量的、多抗原的血液分型平臺提供了條件。不過SPR生物傳感器在定量分析研究中仍存在一些問題。目前大部分基于SPR生物傳感器的檢測方法都依賴于大型儀器，成本高昂，主要用于實驗室研究。許多檢測場合，如果取樣后送回實驗室分析，將降低檢測的速度和準確性。因此，需要開發(fā)更便于攜帶的SPR生物傳感器，以推廣SPR技術在生活中的應用。近年來，已有多個實驗室開展了便攜式SPR生物傳感器的研究[27-28]，隨著研究不斷深入，SPR技術在生活中的應用將會越來越廣，隨著科技的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，該技術可結合其他技術，在臨床醫(yī)學檢測中達到更好的效果，解決更多的醫(yī)學難題，具有非?？捎^的發(fā)展前景。