農(nóng)用植物酵素液中梨樹腐爛病菌拮抗細(xì)菌的篩選和防病效果

郁帆, 馮瑩, 韓劍,2, 盛強(qiáng), 孫麗英, 羅明,2*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；3.新疆巴音郭勒蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆 庫爾勒 841003；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

庫爾勒香梨(簡稱香梨)(Pyrussinkiangensi)是一個(gè)地域性極強(qiáng)的地方特色品種，主要分布在新疆巴州庫爾勒和阿克蘇地區(qū)，是新疆林果產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。隨著香梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、種植規(guī)模的擴(kuò)大和栽培模式的改變，多種病害相繼發(fā)生，成為影響香梨生產(chǎn)的突出問題[1]。由梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)引起的梨樹腐爛病是梨樹栽培生產(chǎn)中最重要的真菌病害之一，在國內(nèi)梨主產(chǎn)區(qū)均有分布，尤其在香梨上危害最為普遍且嚴(yán)重，重病園病株率高達(dá)77.8%～100%[2]。在梨樹結(jié)果期持續(xù)低溫、凍害或夏季高溫、干燥及管理不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致樹勢(shì)衰弱會(huì)加重病害發(fā)生，造成樹皮腐爛、枝干潰瘍或干枯、大量果樹死亡甚至毀園。隨著樹齡的增加，腐爛病逐年加重，嚴(yán)重威脅香梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。

梨樹腐爛病主要通過刮除病斑、噴施或涂抹化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。目前國內(nèi)尚無防治梨樹腐爛病的專用藥劑，生產(chǎn)上常用石硫合劑、腐植酸銅、甲基硫菌靈和甲硫萘乙酸等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但使用后病斑復(fù)發(fā)率仍達(dá)20%～30%，病害難以根除[4]。當(dāng)前生產(chǎn)中農(nóng)藥使用次數(shù)增多，亂施濫用問題突出，不可避免地造成病原菌抗藥性增加、果品農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等一系列問題，因此，生物防治是現(xiàn)代林果生產(chǎn)發(fā)展的必然選擇。發(fā)掘?qū)Σ≡哂幸志饔玫挠幸嫖⑸?，利用其活體及其活性物質(zhì)研制成生物菌劑防治植物病害，選擇性強(qiáng)且病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，具有安全高效、環(huán)境友好等突出優(yōu)勢(shì)。利用生防菌防治果樹腐爛病國內(nèi)外開展了一些研究，但多數(shù)研究圍繞著蘋果腐爛病的防控展開，集中于從果樹和藥用植物內(nèi)生菌、果樹根際和果園土壤微生物中篩選腐爛病病原菌的拮抗菌，如婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)、埃及青霉(Penicilliumegyptiacum)[5]、螺旋毛殼(Chaetomiumspirale)[6]、極長鏈霉菌(Streptomyceslongissimus)[7]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[8]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[9]等，在抗菌機(jī)理、拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化、室內(nèi)毒力和田間防效試驗(yàn)等方面取得了一定研究成果[10]。但有關(guān)梨樹腐爛病的生物防治研究鮮見報(bào)道。

農(nóng)用植物酵素是利用蔬菜、藥用植物、水果、果皮、果渣和農(nóng)業(yè)廢棄物等多種植物源材料為主要原料加入糖(蜜)和水，經(jīng)天然發(fā)酵或接種菌劑發(fā)酵制成的微生物制品。酵素發(fā)酵技術(shù)于20世紀(jì)90年代由日本引入我國。在種植業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用實(shí)踐表明，農(nóng)用植物酵素將有機(jī)廢棄物資源化利用，且制作簡單、成本低廉、安全環(huán)保，在農(nóng)作物、蔬菜、果樹上葉噴或根施具有活化植物營養(yǎng)、改良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)植物生長、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)等突出功效，展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用價(jià)值與推廣前景[11]。近年來，酵素液對(duì)植物病蟲害的生物防治作用得到人們的關(guān)注。酵素液中的抗菌活性成分對(duì)植物土傳病害和葉面病原菌具有明顯的抑制作用，可顯著提高作物抗病害能力[12]，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。本研究針對(duì)梨黑腐皮殼菌，以前期從各種農(nóng)用植物酵素液中分離出的酵素細(xì)菌為材料，從中篩選具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗菌株，明確其抑菌作用方式，測(cè)定其防病效果，為發(fā)掘生防資源、安全防控梨樹腐爛病提供科學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于促進(jìn)梨產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1酵素液細(xì)菌 本課題組在前期研究中從新疆庫爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)、哈拉玉宮鄉(xiāng)等地采集農(nóng)戶以各種果蔬、中草藥植物(香梨、蘋果、西瓜、甜瓜、甘草、蒲公英、香蔥、大蔥等)為原料自制的酵素發(fā)酵液，采用稀釋平板分離法從中分離、純化出68個(gè)細(xì)菌菌株。

1.1.2病原菌 梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)菌株XJ005由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室從庫爾勒香梨腐爛病病樣中分離、鑒定并保存，經(jīng)測(cè)定為強(qiáng)致病力菌株。

1.1.3培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。

1.2 梨黑腐皮殼菌拮抗菌株篩選

1.2.1拮抗菌的初篩 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗菌的初篩。將活化好的梨黑腐皮殼菌接種于PDA平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后用滅菌打孔器沿菌落邊緣取直徑約6 mm的菌餅，接種在PDA平板(直徑90 mm)中央，再將待篩選的細(xì)菌菌株點(diǎn)接于距平板邊緣20 mm處等距離的上、下、左、右4個(gè)位置，以只接種梨黑腐皮殼菌的平板作為對(duì)照，每菌株重復(fù)測(cè)定3皿，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落長滿平板，觀察并記錄有無抑菌圈產(chǎn)生并用十字交叉法測(cè)量處理病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次，初篩出對(duì)梨黑腐皮殼菌有明顯拮抗作用的細(xì)菌菌株。

1.2.2拮抗菌的復(fù)篩 ①拮抗菌發(fā)酵液的制備：將初篩拮抗菌株在NA平板上活化后，用接種環(huán)移取一環(huán)接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，150 r·min-1、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)1～2 d，至細(xì)菌發(fā)酵液OD600為0.8～1.0。

②發(fā)酵液抑菌作用測(cè)定：濾紙片法。在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病菌菌餅，在距培養(yǎng)皿邊緣20 mm處上、下、左、右4個(gè)位置放置直徑為5 mm的滅菌濾紙片，每紙片滴加5 μL初篩拮抗菌的發(fā)酵液，以加入5 μL NB培養(yǎng)液的處理作為對(duì)照，每處理重復(fù)3皿，25 ℃暗培養(yǎng)3 d后十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑(mm)，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[(對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌直徑)/(對(duì)照病原菌直徑-6)]×100%

(1)

③除菌發(fā)酵濾液的抑菌作用測(cè)定：牛津杯法。將初篩拮抗菌株發(fā)酵液在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到除菌發(fā)酵濾液。抑菌作用的測(cè)定用濾紙片法。

1.3 梨黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)率測(cè)定

1.3.1梨黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)率測(cè)定 在香梨果園采集腐爛病發(fā)病枝條，切取帶有梨黑腐皮殼菌分生孢子器的樹皮組織保濕，待分生孢子角溢出后，以香梨果實(shí)煎汁為培養(yǎng)液，制備成濃度為106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。將拮抗菌發(fā)酵液或除菌發(fā)酵濾液與孢子懸浮液各取25 μL滴在載玻片中央，并置于裝有1%水瓊脂的培養(yǎng)皿中密封，以滅菌培養(yǎng)基與孢子懸浮液混合為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。25 ℃恒溫保濕，分別于12、24和36 h后顯微鏡下觀察記錄孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/(對(duì)照孢子萌發(fā)率)]×100%

(2)

1.3.2梨黑腐皮殼菌菌絲生長觀察 將活化的梨黑腐皮殼菌菌餅接種于PDA平板中央，拮抗菌株點(diǎn)接于四周，25 ℃恒溫對(duì)峙暗培養(yǎng)，以未接種拮抗菌的梨黑腐皮殼菌菌絲作為對(duì)照。觀察拮抗菌菌落和梨黑腐皮殼菌菌落之間產(chǎn)生的抑菌帶，5 d后挑取抑菌圈邊緣的梨黑腐皮殼菌菌絲，在光學(xué)顯微鏡(LWD300-38LFT)下觀察其形態(tài)變化并拍照。

1.4 離體枝條法測(cè)定拮抗菌株對(duì)腐爛病的防效

在庫爾勒市香梨果園采集香梨樹當(dāng)年生枝條，剪取粗細(xì)一致、長30 cm的枝段，無菌水沖洗三次后用75%乙醇溶液浸泡5 min，晾干，兩端封蠟防止水分散失。用手術(shù)刀切出直徑為5 mm的圓形傷口，取一小塊(約1 cm2)滅菌的脫脂棉蘸取1 mL拮抗菌發(fā)酵液(OD600=0.8～1.0)或不同稀釋倍數(shù)的除菌發(fā)酵濾液貼在傷口部位，用保鮮膜包裹保濕，24 h后再接種新鮮培養(yǎng)的梨黑腐皮殼菌菌餅(Ф=5 mm)1塊，每個(gè)枝條2個(gè)接種點(diǎn)，重復(fù)5個(gè)枝條。同法設(shè)置先用滅菌的脫脂棉蘸取1 mL無菌培養(yǎng)基貼敷枝條傷口，保濕24 h后再接種梨黑腐皮殼菌菌餅的處理為對(duì)照。將處理后的枝條放置在塑料托盤中，盤底鋪有加無菌水的滅菌吸水紙，盤口覆蓋保鮮膜保濕，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄腐爛病的發(fā)生情況。7 d后測(cè)量病斑大小并按照公式計(jì)算病斑面積，統(tǒng)計(jì)防治效果。

病斑面積=π×病斑長邊半徑×病斑短邊半徑

(3)

防治效果=[(對(duì)照病斑面積-處理病斑面積)/對(duì)照病斑面積]×100%

(4)

1.5 拮抗菌株的鑒定

1.5.1形態(tài)及生理生化特征鑒定 參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行形態(tài)及生理生化特征測(cè)定。將拮抗菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并描述菌落形態(tài)特征。革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)及染色反應(yīng)；芽孢染色觀察芽孢形狀及著生位置。采用北京陸橋技術(shù)股份有限公司的微量生化鑒定管測(cè)定菌株的VP、MR、H2S、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)氣、接觸酶、氧化酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗(yàn)反應(yīng)及對(duì)乳糖、木糖、果糖和甘露糖等碳源的利用。

1.5.216S rRNA和gyrA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)樹發(fā)育分析 以細(xì)菌基因組柱式提取試劑盒(天根)提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，16S rRNA的上、下游引物分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTG-TTACGA-3′，gyrA基因的上、下游引物分別為F：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和R：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA、Taq聚合酶和dNTPs各1 μL，上、下游引物各1.5 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后提交上海生工生物工程有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA 5.05軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對(duì)梨黑腐皮殼菌的抑菌作用

通過平板對(duì)峙，從分離于各種植物酵素液的68株細(xì)菌中初篩出15株對(duì)梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，抑菌率為41.25%～74.14%(表1)。

表1 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對(duì)梨黑腐皮殼菌抑菌作用初篩結(jié)果

其中，gjfn2、gjfn4、PFN41、PFN30、PGY-FX65、X2FN25和YC-FX74具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌率在70%以上。gjfn4的抑菌效果如圖1所示。

A：菌體與Valsa pyri對(duì)峙培養(yǎng)；B：發(fā)酵液與Valsa pyri對(duì)峙培養(yǎng)；C：除菌發(fā)酵濾液與Valsa pyri對(duì)峙培養(yǎng)；D：正常生長的梨黑腐皮殼菌

通過濾紙片法、牛津杯法測(cè)定初篩菌株發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液的抑菌作用，對(duì)拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67抑菌作用顯著，發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液的抑菌率均分別大于70%和60%，顯著高于其他11個(gè)菌株(表2)。因此,選取gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67做進(jìn)一步研究。

表2 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對(duì)梨黑腐皮殼菌抑菌作用的復(fù)篩

2.2 拮抗菌對(duì)梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用

2.2.1對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制作用 測(cè)定gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對(duì)梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用，結(jié)果(表3)表明，4個(gè)拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對(duì)梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)率。其中，gjfn4和PFN41對(duì)梨黑腐皮殼菌分生孢子的抑制作用最為顯著，在發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液中36 h分生孢子不能萌發(fā)，抑制率均達(dá)到100%。

表3 拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對(duì)梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果

2.2.2拮抗菌株對(duì)梨黑腐皮殼菌絲生長的抑制作用 將拮抗菌株gjfn4與梨黑腐皮殼菌對(duì)峙培養(yǎng)5 d后顯微觀察(圖2)顯示，對(duì)照梨黑腐皮殼菌菌絲生長正常，菌絲較細(xì)、均勻一致、表面光滑、平直；而受gjfn4抑制的梨黑腐皮殼菌菌絲生長異常，如菌絲加粗、顏色變深、不規(guī)則彎曲增多、分枝增加、節(jié)間短、頂端膨大、畸形、部分膨大細(xì)胞破裂、細(xì)胞質(zhì)外滲等。

A：正常菌絲；B～C：gjfn4作用后的畸形菌絲

2.3 拮抗細(xì)菌對(duì)梨樹腐爛病防治效果

采用離體枝條法測(cè)定拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對(duì)梨樹腐爛病的防效，結(jié)果(表4)表明，未接種拮抗菌的對(duì)照在接種梨黑腐皮殼菌1～2 d后枝條上出現(xiàn)典型病斑，并迅速擴(kuò)展；而噴施gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液后再接種病原菌的處理能有效抑制病斑的擴(kuò)展速度、減緩顯癥時(shí)間(3 d后)，且病斑面積均顯著低于對(duì)照。4個(gè)菌株發(fā)酵液的防效均達(dá)到79%以上，除菌發(fā)酵濾液原液防效均達(dá)73%以上，發(fā)酵液防效略高于除菌發(fā)酵濾液。4個(gè)菌株中，gjfn4菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵濾液原液和除菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液的防效分別為84.79%、81.57%和67.27%，防效最佳。

表4 拮抗細(xì)菌對(duì)梨樹腐爛病的離體枝條防效

2.4 拮抗菌株的鑒定

2.4.1形態(tài)特征及生理生化特性 對(duì)拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67的形態(tài)特征、生理生化特性進(jìn)行觀察測(cè)定，結(jié)果(表5)表明，4個(gè)菌株在菌落、菌體形態(tài)和生理生化特性上均符合芽孢桿菌屬特征。gjfn2、gjfn4和PFN41菌株在NA培養(yǎng)基上菌落均呈圓形、乳白色，表面粗造、邊緣不規(guī)則，菌體桿狀，G+，芽孢中央位；在VP、甲基紅、H2S、革蘭氏染色、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)氣、接觸酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗(yàn)中均呈陽性反應(yīng)；氧化酶、乳糖、木糖、甘露糖試驗(yàn)中均呈陰性反應(yīng)；其特性與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)一致。PFN41在NA培養(yǎng)基上菌落稍隆起、芽孢囊彭大，甲基紅、H2S、丙二酸鹽試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，氧化酶試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，其特性與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)一致。

表5 拮抗菌株的形態(tài)和生理生化特性

2.4.216S rRNA和gyrA基因序列分析 以菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67的總DNA為模板進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，均得到一條大小約為1 500 bp的條帶，經(jīng)測(cè)定序列全長分別為1 438、1 438、1 440和1 438 bp，GenBank登錄號(hào)分別為MW255029、MW255046、MW255043和MW266937。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并下載與其相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)表明，菌株P(guān)GY-FX67、PFN41和gjfn4聚為一類，同時(shí)又和gjfn2、貝萊斯芽孢桿菌C1聚在一個(gè)分支，與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株NRRL B-41580T相似性最高，達(dá)99.8%～99.9%。

圖3 基于16S rRNA構(gòu)建的4個(gè)拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌枯草亞種(B.subtilissubsp.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌為相近種，序列相似性高于物種劃分推薦的閾值(98.65%)。因此，僅通過16S rRNA基因序列分析不能有效區(qū)分。進(jìn)一步對(duì)供試菌株的持家基因gyrA進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得了1 000 bp左右的特異性目標(biāo)條帶，提交GenBank獲得登錄號(hào)分別為MW316629、MW316630、MW316631、MW316632。系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)顯示，gjfn2、PGY-FX67菌株與B.velezensisONU 553(CP043416)的序列相似性達(dá)100%；gjfn4菌株與貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisCBMB205(NZ_CP011937)的序列相似性達(dá)到100%；PFN41號(hào)菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensPG12(KC797584)的序列相似性達(dá)到100%。綜合培養(yǎng)性狀、形態(tài)及生理生化特征，將gjfn2、gjfn4、PGY-FX67鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 基于gyrA基因構(gòu)建的4個(gè)拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

酵素液發(fā)酵過程中有豐富的復(fù)合菌群參與，產(chǎn)生多種營養(yǎng)及有機(jī)酸、酚類、活性酶、生物表面活性劑等活性物質(zhì)[15]，具有改善植物營養(yǎng)和抗菌殺蟲的功效。近期，本課題組從西、甜瓜酵素液細(xì)菌中分離到XG-FX22和G-FX12菌株，對(duì)梨腐爛病的防效顯著高于內(nèi)生細(xì)菌[16]，由此表明，酵素液是獲得高效拮抗菌的重要來源。本研究從新疆庫爾勒果農(nóng)利用各種果蔬原料經(jīng)天然發(fā)酵制備的酵素液中分離的68株細(xì)菌中，采用平板對(duì)峙試驗(yàn)初篩選出了15株對(duì)梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，篩選概率達(dá)22.1%；抑菌率為41.25%～74.14%，其中有7個(gè)菌株的抑菌率大于70%。通過發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液復(fù)篩出4株抑菌效果顯著的菌株，通過香梨離體枝條測(cè)定其防病效果，結(jié)果表明，4個(gè)菌株的發(fā)酵液防效均達(dá)到79%以上，除菌發(fā)酵濾液防效均達(dá)到73%以上。其中g(shù)jfn4菌株的發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液防效俱佳，均達(dá)到80%以上，且除菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液的防效仍能保持在60%以上，具有作為香梨腐爛病生防菌的良好潛力。本研究結(jié)果再次證實(shí)了在酵素液中存在有大量的拮抗菌株，是獲得高抗菌活性菌株的新來源。

近年來，農(nóng)用植物酵素液在抑制病原菌生長、增強(qiáng)植物抗病性方面的功效不斷地被研究發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知。耿健等[17]利用芳香植物孔雀草、薄荷發(fā)酵制成的酵素液噴施梨樹，能有效防治梨黑心病、腐爛病和輪紋病的發(fā)生，對(duì)梨樹葉片生長、光合特性和果實(shí)品質(zhì)均具有促進(jìn)作用。黃偉菁等[18]證實(shí)噴施蘋果幼果酵素液能夠明顯促進(jìn)樹體生長，改善果實(shí)品質(zhì)，減少α-法呢烯的含量，降低蘋果虎皮病的發(fā)生率。王榮娟等[19]發(fā)現(xiàn)在蘋果樹上噴施蘋果果實(shí)酵素液，可提高活性氧含量和抗氧化酶活性，有效誘導(dǎo)蘋果葉片對(duì)斑點(diǎn)落葉病的抗性。但在應(yīng)用植物酵素過程中也發(fā)現(xiàn)，由于原料成分多樣、參與天然發(fā)酵的菌種復(fù)雜、易污染有害雜菌、復(fù)合菌群發(fā)酵過程易受環(huán)境影響、代謝產(chǎn)物難以控制等因素而造成酵素質(zhì)量良莠不齊、使用效果不穩(wěn)定等問題[20-21]。制作植物酵素液是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵過程，在多種菌種復(fù)合共同作用下，使發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)變化，形成抗氧化物、有機(jī)酸、酶類和次生代謝產(chǎn)物等抗菌成分。由于發(fā)酵菌種不同、原料不同、工藝不同，所以發(fā)酵過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化也不盡相同，但參與發(fā)酵的菌種與酵素液的生防功能密不可分。因此，從酵素液中篩選出抗菌功能菌株，對(duì)于明確其功能性成分和發(fā)酵機(jī)理、產(chǎn)品質(zhì)量調(diào)控及開發(fā)利用都具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的植物酵素液中分離出的菌種通常是酵母菌和醋酸菌、乳酸菌等[22]。朱會(huì)霞等[23]通過高通量測(cè)序檢測(cè)水果酵素發(fā)酵過程中的細(xì)菌變化，發(fā)現(xiàn)正常發(fā)酵主要的細(xì)菌有醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、酸硫桿狀菌、明串珠菌和嗜酸菌。本研究從酵素液分離細(xì)菌中篩選出的4株梨腐爛病生防潛力菌株均為芽孢桿菌屬，經(jīng)鑒定gjfn2、gjfn4、PGY-FX67為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41為解淀粉芽孢桿菌。這可能是由于芽孢桿菌廣泛棲息于植物體表、體內(nèi)和空氣、水等環(huán)境中，在酵素液發(fā)酵過程中生長快，抗逆性強(qiáng)，耐受高酸、高滲透壓環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，因而在發(fā)酵過程中與有害菌的競爭中更具優(yōu)勢(shì)。貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是目前備受關(guān)注的重要生防細(xì)菌，具有對(duì)多種植物病原菌的抗菌活性及促進(jìn)植物生長的作用[24-25]，但對(duì)梨腐爛病防治作用研究尚未見報(bào)道。

拮抗菌株對(duì)梨黑腐皮殼菌的抑制作用研究表明，4個(gè)拮抗菌株的發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)率。顯微觀察顯示，拮抗菌造成梨黑腐皮殼菌菌絲加粗、不規(guī)則彎曲增加、頂端膨大畸形及細(xì)胞原生質(zhì)外滲。離體防效試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液對(duì)香梨腐爛病的防效接近，說明其代謝產(chǎn)物在防病過程中起重要作用。呂前前等[26]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌菌株BaA-007對(duì)蘋果腐爛病菌的作用機(jī)制是分泌次生代謝物和激活JA、SA、ET和細(xì)胞壁相關(guān)抗性反應(yīng)抑制腐爛病斑擴(kuò)展。程超[27]從產(chǎn)酶溶桿菌(L.enzymogenes)OH11次生代謝產(chǎn)物中分離的HSAF(heat stable antifungal factor)對(duì)梨黑腐皮殼菌有較強(qiáng)的生長抑制作用，EC50值為0.5 μg·mL-1。利用微生物次生代謝物開發(fā)生物農(nóng)藥，可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，耐貯性好，功效穩(wěn)定，對(duì)防控植物病害更具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。本研究從植物酵素液中篩選獲得的梨腐爛病生防潛力菌株，其田間防效是否理想有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，菌株的抑菌機(jī)制及抑菌物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性等都需在今后工作中進(jìn)行更加深入的研究。