鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境微生物菌群結(jié)構(gòu)及潛在病原菌分析

黃 薇 周華書(shū) 劉蘭英 羅土炎 宋永康

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350003;2. 周寧縣水產(chǎn)技術(shù)站, 周寧 355400)

鱘鰉魚(yú)是地球上現(xiàn)存最古老的脊椎動(dòng)物, 包括鱘屬Acipenser和鰉屬Huso, 共2屬21種, 其中我國(guó)擁有8種，是鱘鰉魚(yú)分布較多的國(guó)家[1]。目前, 鱘鰉魚(yú)的所有屬種均被列入世界珍稀瀕危物種, 如何妥善保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用這些珍稀瀕危物種, 已成為全世界亟不可待的研究課題[1,2]。近年來(lái), 隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化鱘鰉魚(yú)細(xì)菌性疾病發(fā)生率不斷增加, 給這一珍貴物種造成了不可彌補(bǔ)的巨大損失[3]。

魚(yú)類的健康狀況與其生活的水環(huán)境密切相關(guān)[4]。水環(huán)境中生存著大量的已知和未知的細(xì)菌菌群, 在水質(zhì)調(diào)控、物質(zhì)代謝、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定及疾病的發(fā)生與控制等方面都發(fā)揮著重要的作用[5]。崔丙健等[6]認(rèn)為, 盡管在養(yǎng)殖水環(huán)境中病原菌的豐度較低, 但也可能在特定條件下大量增殖, 從而導(dǎo)致水產(chǎn)病害暴發(fā)。同時(shí)研究顯示, 養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌的數(shù)量和種類與魚(yú)類疾病的發(fā)生幾率及發(fā)病類型呈顯著正相關(guān)[7]。因此, 為了更好的保護(hù)和培育鱘鰉魚(yú)這一珍貴物種, 闡明其養(yǎng)殖環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)組成是有必要的, 理解養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物種類和數(shù)量將有助于調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)平衡、疾病防控及病原菌的快速診斷。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者在部分魚(yú)類養(yǎng)殖水環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成方面的研究已經(jīng)取得了初步進(jìn)展, 包括大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)[8]、羅非魚(yú)(Tilapia larvae)[9]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[10]和淡水蝦[11]等。然而對(duì)鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)組成研究尚未見(jiàn)到報(bào)道。因此, 本文采用高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)手段對(duì)福建省周寧縣中華鱘保種中心穩(wěn)定養(yǎng)殖的4個(gè)鱘鰉魚(yú)品種的網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及潛在病原菌存在情況進(jìn)行了分析, 為該中心鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的水質(zhì)調(diào)控及疾病預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品來(lái)源于福建省周寧縣中華鱘保種中心(北緯27°11′, 東經(jīng)119°20′), 該中心的鱘鰉魚(yú)為水庫(kù)網(wǎng)箱養(yǎng)殖, 養(yǎng)殖區(qū)平均海拔700 m, 網(wǎng)箱6 m深水溫為13—23℃, 晝夜溫差不超過(guò)2℃, pH為6.8—7.2,網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度約200尾/網(wǎng)箱, 養(yǎng)殖所用餌料為人工配合飼料, 每天早晚投喂1次, 日投喂率為魚(yú)體體重的0.5%。樣品于2019年9月12日采集, 隨機(jī)選取中心穩(wěn)定養(yǎng)殖的4個(gè)鱘鰉魚(yú)品種(中華鱘A. sinensis、施氏鱘A. schrenckii、達(dá)氏鰉H. dauricus和大雜交鱘A. schrenckii♂×H. dauricus♀)養(yǎng)殖網(wǎng)箱各3個(gè), 在每個(gè)網(wǎng)箱的四角各設(shè)1個(gè)采樣站位, 利用500 mL的含0.4 mg硫代硫酸鈉的無(wú)菌水樣采集袋采集水深5 m處(網(wǎng)箱水深6 m)的水樣, 將各網(wǎng)箱采集的水樣混合均勻后裝于滅菌容器, 4℃運(yùn)輸和保存, 樣品相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定和DNA提取在24h內(nèi)完成。樣品命名: 中華鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為Z1、Z2和Z3,施氏鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為S1、S2和S3, 達(dá)氏鰉網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為H1、H2和H3, 大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品編號(hào)為D1、D2和D3。

1.2 水質(zhì)測(cè)定

水溫、pH和溶解氧(DO)均在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行測(cè)定,采用便攜式多參數(shù)測(cè)試儀SG68-ELK-ISM(MettlerToledo, Zurich, Switzerland)進(jìn)行測(cè)定, 儀器使用前均已校正。實(shí)驗(yàn)室測(cè)定指標(biāo)包括氨氮N)、總磷(TP)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)和五日生化需氧量(BOD5), 分析方法如下:N采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009)、TP采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989)、CODMn采用酸式滴定法(GB11892-1989)和BOD5采用稀釋與接種法(HJ05-2009)。

1.3 基因組DNA提取

取各網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體1 L, 首先利用5.0 μm濾膜濾去浮游動(dòng)植物和大顆粒物; 再利用0.22 μm濾膜截留微生物。獲得的濾膜樣品利用強(qiáng)力水樣微生物總DNA提取試劑盒(MOBIO, Carlsbad, CA, USA)提取DNA, 用Qubit 2.0 熒光定量?jī)x(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進(jìn)行定量, 提取的DNA樣品放置在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增和Illumina測(cè)序

PCR擴(kuò)增采用16S rRNA基因V3—V4區(qū)的通用引物341F和805R。PCR反應(yīng)體系總體積 30 μL, 含模板DNA 20 ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃, 3min;(94℃, 30s; 45℃, 20s; 65℃, 30s)×5; (94℃, 20s;55℃, 20s; 72℃,30 s)×20; 72℃, 5min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick PCR 純化試劑盒(Qiagen,Düsseldorf, Germany)純化后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序, 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)提交到NCBI的 SRA數(shù)據(jù)庫(kù), 序列登錄號(hào)為SRP251784。

1.5 高通量數(shù)據(jù)處理

Illumina MiSeq測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù), 首先使用FLASH軟件[12]根據(jù)序列間的overlap關(guān)系將成對(duì)的序列拼接成一條序列; 再運(yùn)用Cutadapt軟件[13]去除測(cè)序時(shí)加入的引物和接頭序列, 按照barcode標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品; 然后使用Prinseq軟件[14]對(duì)各樣品數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾; 所得各樣本的有效數(shù)據(jù)再經(jīng)過(guò)Usearch軟件[15]去除嵌合體以及進(jìn)行Operational Taxonomic Units (OTUs)聚類分析; 對(duì)OTU代表序列利用Ribosomal Database Project (RDP)classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋[16]; 利用Mothur軟件對(duì)單樣品的微生物多樣性(alpha多樣性)進(jìn)行分析[17]; 采用QIIME軟件計(jì)算兩兩樣本間的weighted UniFrac距離, 用于beta多樣性分析[18]。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及定量PCR

參考文獻(xiàn)中報(bào)道的鱘鰉魚(yú)典型致病菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物序列, 經(jīng)過(guò)多重比對(duì)驗(yàn)證試驗(yàn)后, 篩選出3對(duì)PCR引物(表 1)。以所提樣品DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后, 與pMD18-T載體接連轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中, 挑取轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性克隆子利用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen, Düsseldorf,Germany)提取質(zhì)粒DNA, 送測(cè)序公司驗(yàn)證插入的基因片段是否正確, 驗(yàn)證正確后測(cè)定質(zhì)粒濃度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)的引物Tab. 1 RT-PCR primers sequences used in assay

將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板, 采用LightCycler480 II型熒光定量PCR儀(Roche,Rotkreuz, Switzerland)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積 10 μL, 含2×SG Fast qPCR Master Mix 5 μL, 模板DNA 10 ng。熒光定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃, 3min; (95℃, 5s;55/60℃, 30s; 72℃, 45s)× 45; 72℃, 10min。熔解曲線條件: 95℃, 1min; 55℃, 30s; 95℃, 30s。所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每輪反應(yīng)均以無(wú)菌 ddH2O 代替模板DNA作為陰性對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在本研究中, 平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差采用Excel軟件計(jì)算;P-values采用SPSS軟件計(jì)算, 單因素方差分析運(yùn)用Least Significant Difference (LSD法); PCoA圖、柱狀圖、熱圖和韋恩圖采用R軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體水質(zhì)分析

從表 2可以看出, 中華鱘保種中心水庫(kù)水質(zhì)良好, 水溫適合鱘魚(yú)生長(zhǎng), pH呈中性, 網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的DO、和CODMn達(dá)到Ⅱ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),BOD5和TP達(dá)到Ⅲ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。中華鱘及其他鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)含量基本一致, 除BOD5外, 不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的水質(zhì)指標(biāo)含量不存在顯著差異(P≥0.05)。

表2 四種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體水質(zhì)分析Tab. 2 The characteristics of water quality in four sturgeon species cage culture environments (mean±SEM, n=3)

2.2 鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征分析

從表 3可知, 中華鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉和大雜交鱘養(yǎng)殖水環(huán)境樣品中分別獲得有效16S rRNA序列數(shù)為51537±3709、66785±13726、56344±19476和58587±7538 條, 平均每個(gè)樣品獲得OTUs為1163個(gè)。根據(jù)各樣品的Good’s coverage指數(shù)＞99%,可知本研究的測(cè)序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。Alpha多樣性分析結(jié)果表明, 大雜交鱘養(yǎng)殖水體的OTUs及ACE要顯著高于其他品種, 表明大雜交鱘養(yǎng)殖水體中的物種總數(shù)較高。一般來(lái)說(shuō),BOD5值越高, 水質(zhì)有機(jī)物濃度越高, 細(xì)菌的物種數(shù)也會(huì)越豐富。除此之外, 其余Alpha多樣性指數(shù)(Chaol、Shannon和Simpson)無(wú)顯著性差異(P≥0.05), 表明各樣品間的微生物結(jié)構(gòu)組成基本一致。根據(jù)weighted Unifrac距離進(jìn)行PCoA分析, 從分析結(jié)果可知(圖 1), PCoA圖的前3個(gè)主坐標(biāo)可以代表83.1%的變量信息, 除其中一個(gè)中華鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品外, 其余樣品均聚在一起, 表明這些鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體中的微生物結(jié)構(gòu)和組成十分相似。

表3 Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Tab. 3 Statistical indexes calculated based on the Illumina sequencing data (mean±SEM, n=3)

圖1 基于weighted UniFrac距離的樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析Fig. 1 Principal coordinates analysis (PCoA) of community compositions in samples microbiota based on weighted UniFrac

12個(gè)鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體樣品共獲得20個(gè)門類細(xì)菌(圖 2)。不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌門基本一致, 均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成, 這些優(yōu)勢(shì)門類分別占到所有樣品序列總數(shù)的88.81%—93.94%。其中, 豐度最高的菌門為Proteobacteria, 占樣品序列總數(shù)的35.98%—39.94%,其次是Actinobacteria, 占樣本序列總數(shù)的21.77%—24.70%。差異顯著性分析結(jié)果顯示, 這些優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門在各鱘鰉品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的豐度不存在顯著性差異(P≥0.05), 說(shuō)明各鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的微生物結(jié)構(gòu)組成在門水平上基本一致。

圖2 門水平下各鱘鰉魚(yú)品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 2 The taxonomic composition distribution in samples at the phylum level

在各鱘鰉魚(yú)品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中, 共檢測(cè)到224個(gè)細(xì)菌屬, 對(duì)豐度前50的細(xì)菌屬進(jìn)行熱圖分析(圖 3), 養(yǎng)殖水體中細(xì)菌種群有高達(dá)34.77%—58.81%的物種未分類, 除此之外相對(duì)豐度在2%以上的細(xì)菌屬主要有Ilumatobacter(3.59±0.97)%、Sediminibacterium(2.38±0.56)%、Acinetobacter(2.53±3.33)%、Spartobacteria_genera_incertae_sedis(2.13±0.68)%和Subdivision3_genera_incertae_sedis(2.01±1.91)%。同時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 這些優(yōu)勢(shì)菌屬在各鱘鰉品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體的差異不顯著(P≥0.05), 表明在屬水平上, 各鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)構(gòu)組成相似。

圖3 屬水平下各鱘鰉魚(yú)品種網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 3 The taxonomic composition distribution in samples at the genus level

2.3 鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落組成比較分析

通過(guò)構(gòu)建韋恩圖來(lái)分析不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中所共有的和特有的OTU數(shù)目(圖 4)。中華鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體共有了1059個(gè)OTUs, 統(tǒng)計(jì)分析表明, 共有的OTUs序列分別占中華鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體序列總數(shù)的99.13%、98.44%、99.21%和99.18%。因此, 不同鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的核心菌群是一致的。此外, 中華鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中還含有特有的OTUs分別為70、156、43和68個(gè), 分別占中華鱘、施氏鱘、達(dá)氏鰉和大雜交鱘網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體總序列數(shù)的0.13%、0.51%、0.08%和0.09%。

圖4 不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中共有的和特有的OTUsFig. 4 Venn diagram displaying the number of shared and unique OTUs in the different sturgeon cage culture water

2.4 中華鱘及其他鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體中潛在病原菌分析

在本研究檢測(cè)的網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣品中共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚(yú)病原菌菌屬7個(gè), 主要包括Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio。從表 4可以看出, 7個(gè)潛在病原菌菌屬在不同鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體中的分布規(guī)律較為接近, 但是7個(gè)潛在致病菌菌屬的相對(duì)豐度存在顯著性差異(P＜0.05), 除中華鱘養(yǎng)殖水體中Pseudomonas＞Flavobacterium外, 其余相對(duì)豐度大小均表現(xiàn)為:Acinetobacter＞Flavobacterium＞Pseudomonas＞Aeromoas＞Chryseobacterium＞Vibrio＞Edwardsiella。

表4 不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中潛在病原菌屬及分布Tab. 4 Potential pathogens distribution in the different sturgeon cage culture water (mean±SEM, n=3)

利用熒光定量PCR對(duì)已報(bào)道鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的典型病原菌進(jìn)行檢測(cè)。從圖 5可以看出,A. hydrophila在養(yǎng)殖水體中的豐度[(7406±1892) copies/mL]要高于或顯著高于(P＜0.05)其他病原菌, 其次為F. columnar[(4889±1649) copies/mL)和P. fluorescens[(3259±1117) copies/mL)。

圖5 網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中病原微生物豐度Fig. 5 Frequency of pathogenic microorganisms in cage culture water

3 討論

養(yǎng)殖水體中存在著大量的已知和未知微生物,其與水生生物體內(nèi)寄生的微生物菌群相互作用、相互影響, 形成了復(fù)雜的細(xì)菌-細(xì)菌、細(xì)菌-宿主互作關(guān)系, 從而對(duì)水生生物的健康成長(zhǎng)產(chǎn)生重要的影響[20]。大量的研究表明, 明確養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成將有助于病害控制防治、益生菌篩選及病原菌發(fā)病機(jī)制研究等工作[8,21]。因此, 本研究采用高通量測(cè)序技術(shù), 對(duì)4種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的微生物的結(jié)構(gòu)組成及潛在病原菌分布進(jìn)行了分析和比較。

從16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果來(lái)看, 不同品種鱘鰉魚(yú)在同一水域同一管理?xiàng)l件下, 其養(yǎng)殖水體中核心菌群基本一致, 優(yōu)勢(shì)菌群主要由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成, 這與已報(bào)道的羅非魚(yú)[22]、草魚(yú)[23]、魚(yú)菜共生[24]和魚(yú)貝混養(yǎng)[25]等養(yǎng)殖水環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌群相似。研究顯示, Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes在脫氮除磷、降解大分子、有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)換及產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)等密切相關(guān), 這些優(yōu)勢(shì)微生物的存在對(duì)于魚(yú)類健康養(yǎng)殖有重要意義[24,26,27]。而Verrucomicrobia是污染程度的指示菌群[28], 在未受污染的沉積物中普遍存在, 在污染的沉積物中出現(xiàn)缺失, 這與本研究檢測(cè)出鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水質(zhì)指標(biāo)較好(處于Ⅱ—Ⅲ級(jí))相吻合。同時(shí), 新近的研究顯示, 魚(yú)類腸道中的優(yōu)勢(shì)微生物也來(lái)自于Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes[29,30], 這在一定程度上也說(shuō)明了水生生物與其水環(huán)境中的微生物之間存在緊密的互作關(guān)系。

在屬水平上, 各樣品未分類的細(xì)菌(unclassified)占比都超過(guò)34%, 占比最高達(dá)到58.81%, 說(shuō)明鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖水體中的微生物種類復(fù)雜多樣, 有大量的微生物未被人們熟知, 同時(shí)也表明利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離等方法很難得到全面、準(zhǔn)確的結(jié)果[31]。因此, 為了更好地培育這一珍貴物種, 采用高通量測(cè)序技術(shù)闡明其養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)組成十分必要。在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中, 養(yǎng)殖環(huán)境中的許多致病菌, 尤其是條件致病菌大量增殖導(dǎo)致的水產(chǎn)病害頻發(fā)是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程面臨的主要問(wèn)題[6]。該結(jié)果證實(shí)了鱘鰉魚(yú)典型病原菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的普遍性, 本文采用高通量測(cè)序技術(shù)在網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體樣本中共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚(yú)病原菌菌屬7個(gè)。

基于16S rRNA片段基因高通量測(cè)序技術(shù)能夠解析樣本中微生物的總體結(jié)構(gòu), 取得更多不能通過(guò)分離培養(yǎng)技術(shù)獲取的細(xì)菌種類信息, 但限于二代高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序長(zhǎng)度偏短, 其對(duì)于具體到種一級(jí)的信息辨別能力不足[20], 這對(duì)于獲取種間關(guān)系復(fù)雜的病原菌信息難度較大。為此, 本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境水體樣品中常見(jiàn)的典型鱘鰉魚(yú)致病菌進(jìn)行定量檢測(cè), 檢測(cè)結(jié)果顯示A. hydrophila在養(yǎng)殖水體中的豐度要高于F. columnar和P. fluorescens, 這與高通量測(cè)序檢測(cè)的致病菌屬結(jié)果不一致。盡管16S rRNA基因片段的PCR引物擴(kuò)增的特異性會(huì)出現(xiàn)一定的差異, 但推測(cè)主要原因還是在于致病菌屬包含了不止一種的致病菌種。Aeromoas廣泛存在于自然界及健康魚(yú)體的腸道中,屬于條件致病菌。根據(jù)田甜等[3]和楊移斌等[32]的報(bào)道,A. hydrophila是中華鱘及其他鱘鰉魚(yú)病害最常見(jiàn)的病原菌, 可導(dǎo)致紅嘴病、腹水病和敗血癥等的發(fā)生。在鱘鰉魚(yú)的養(yǎng)殖過(guò)程中, 病原菌的早期監(jiān)控對(duì)疾病防控具有極為重要的作用, 本研究的結(jié)論將有助于針對(duì)性地指導(dǎo)對(duì)該區(qū)域中華鱘等鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程進(jìn)行科學(xué)防病和水質(zhì)調(diào)控。

4 結(jié)論

在同一水域同一管理?xiàng)l件下, 不同品種鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌組成與豐度基本一致, 優(yōu)勢(shì)菌門均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes組成,優(yōu)勢(shì)菌屬為Ilumatobacter、Sediminibacterium、Acinetobacter、Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Subdivision3_genera_incertae_sedis, 表明不同鱘鰉魚(yú)的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境管理經(jīng)驗(yàn)是可以相互借鑒的。在鱘鰉魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境中, 共發(fā)現(xiàn)鱘鰉魚(yú)病原菌菌屬7個(gè):Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示, 在鱘鰉魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中最常見(jiàn)的病原菌A. hydrophila的豐度最高, 為(7406±1892) copies/mL, 其次F. columnar的豐度為(4889±1649) copies/mL及P.fluorescens的豐度為(3259±1117) copies/mL。