恒定的自然殺傷T淋巴細胞在肝臟抗腫瘤免疫中的作用與機制

胡想金，高 耀，閭 軍

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病與腫瘤生物治療科，北京 100069

恒定的自然殺傷T細胞(invariant natural killer T cell，iNKT 細胞)屬于先天性T淋巴細胞亞群，表達自然殺傷細胞(NK細胞)相關受體的同時也表達T淋巴細胞受體(T cell receptor，TCR)，是固有免疫系統重要組成部分?；罨膇NKT細胞通過釋放細胞因子及細胞間信號傳遞等方式調節(jié)微環(huán)境中適應性免疫細胞活性。iNKT細胞具有組織特異性，主要分布于機體胸腺、肝臟中，目前關于iNKT細胞的組織特異性機制尚未完全明確，但是目前越來越多證據指出iNKT細胞對肝臟免疫系統具有重要的調控作用，與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展關系十分密切，本文就iNKT細胞的生物學特性及其在調節(jié)肝臟免疫反應中的重要作用，尤其就iNKT細胞在肝細胞癌(HCC)中的作用和機制做出綜述。

1 iNKT細胞生物學特性

自然殺傷T淋巴細胞(natural killer T cell，NKT 細胞)是天然的T淋巴細胞亞群，表達NK細胞表面標志物的同時也表達TCR，根據TCR特異性主要分為2個亞群：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ 型NKT細胞表達的TCR由恒定的TCRα鏈(小鼠Vα14-Jα18，人Vα24-Jα18)分別與相應的半恒定TCRβ鏈匹配(小鼠為Vβ8.2、Vβ7或Vβ2，人類為 Vβ11)組成[1]，因此Ⅰ型NKT細胞又被命名為invariant NKT(iNKT)細胞。iNKT細胞可以特異性識別由抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)表面CD1d結合的α-半乳糖神經酰胺(α-GalCer)[2]，正因如此，人們通過利用α-GalCer對iNKT細胞在體外進行大量擴增，因而目前對iNKT細胞的研究及了解較多。而Ⅱ型NKT細胞由于TCR表達多樣性和缺乏特異性，其主要被硫脂類抗原激活，并不受α-GalCer影響，是抑制抗腫瘤免疫的調節(jié)細胞，目前研究較少。本文主要對Ⅰ型NKT細胞，即iNKT細胞進行討論分析。

iNKT細胞雖然是T淋巴細胞的亞群，但較傳統T淋巴細胞仍有諸多不同之處。首先，iNKT細胞對經典的主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ、Ⅱ類分子遞呈的抗原無反應，其主要識別并結合由 CD1d分子(一種非多態(tài)性MHC Ⅰ類抗原遞呈分子)所遞呈的脂質抗原α-GalCer[2]，這使得iNKT細胞在進化過程中具有高度保守的特異性[3]。其次，iNKT細胞活化機制多樣，除了受α-GalCer活化外，iNKT細胞組成性表達IL-12R和IL-18R，可被微環(huán)境中IL-12和IL-18激活，此外通過Toll樣受體信號刺激APC途徑也可介導iNKT細胞活化[4]。第三，iNKT細胞具有強大的免疫調節(jié)功能，活化后的iNKT細胞能迅速分泌大量的細胞因子，如IFNγ、TNFα等，促使APC的活化，特別是誘導樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的成熟，DC通過上調共刺激因子(CD40、CD80、CD86)表達，并通過分泌IL-12和IL-18分別與iNKT細胞表面的CD40L、IL-12R和IL-18R結合進一步促使iNKT細胞活化[5]。更重要的是，iNKT細胞自身分泌的IFNγ及DC來源的IL-12、IFNγ可誘導T淋巴細胞及NK細胞活化，因此iNKT細胞被喻為連接先天性和適應性免疫反應的橋梁[6]。最后，iNKT細胞自身還可以通過CD1d、穿孔素、顆粒酶及Fas/FasL等途徑直接殺傷靶細胞[7]，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

更為特殊的是，iNKT細胞是組織歸巢和組織常駐細胞，根據特定表面標志物和特定轉錄因子可以劃分出不同功能的iNKT細胞亞群，如NKT1(分泌IFNγ為主)、NKT2(分泌IL-4為主)、NKT17(分泌IL-17為主)及NKT10(分泌IL-10為主)等亞群[8]，這些亞群在胸腺分化發(fā)育早期即出現，從胸腺出來以后以組織特異性方式歸巢在外周器官，在肝臟中最為豐富，其次是胸腺、肺、脾[9]，這主要是由于iNKT細胞的組織歸巢和組織定居特性所決定的。這些iNKT細胞亞群能夠分泌不同的細胞因子，調節(jié)不同組織定位的免疫反應。且不同組織定位的iNKT細胞亞群表達的趨化因子受體也有所差異[10-12]，例如，肝內的iNKT細胞表達高水平的CXCR3、CCR5及CCR2，其中CCR2及CCR5是炎癥相關趨化因子受體，為iNKT細胞向肝內遷移及iNKT細胞調節(jié)肝內免疫反應提供了重要作用[13]，進一步提示了iNKT細胞亞群可能以不同組織為靶點，發(fā)揮不同的免疫功能。這種組織特異分布方式也反映出iNKT細胞在肝臟生理及病理狀態(tài)下的免疫微環(huán)境中扮演著重要的角色，包括維持免疫耐受、微生物感染、自身免疫性疾病和癌癥等[14]。

2 iNKT細胞在肝臟免疫中的作用

肝臟是一個獨特的免疫器官，含有豐富的免疫細胞，包括Kupffer細胞(KC)、DC、NK細胞和T淋巴細胞等，其中T淋巴細胞及NK細胞約占肝內淋巴細胞的90%[15]。正常情況下，iNKT細胞在肝竇內巡邏，在那里含有豐富的肝竇內皮細胞及KC，狹小的肝竇不僅減緩了血液流動，肝竇內皮的單層窗孔結構進一步促進了iNKT細胞及KC捕捉病原體和循環(huán)腫瘤細胞的能力[16]。值得注意的是，肝竇內皮細胞、KC等肝內APC表達高水平的CXCL16，吸引更多的CXCR6+iNKT向肝內募集，CXCR6/CXCL16的相互作用也是肝內iNKT細胞排斥異物分子的基礎，CXCR6的缺失會減弱iNKT細胞對肝臟的保護作用[17-18]。此外，如上所述，肝內iNKT細胞表達豐富的CCR2、CCR5、CXCR3等趨化因子受體，會吸引中性粒細胞、單核細胞及髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)向肝內募集，引起肝內炎性免疫反應[19]，增加組織損傷風險。正常的肝臟如何能在肝臟不斷識別病原體外，還能保持肝內免疫系統平衡，這與免疫耐受形成有關，將在后文進行探討。

肝臟是雙血管供血系統，接受營養(yǎng)豐富的門靜脈(75%)和富氧的肝動脈(25%)的雙重血液供應。門靜脈結構的存在使得肝臟除接觸外周血液中病原體外，還可以通過門靜脈吸收來自腸道的病原體[20]。肝臟在長期面對大量外來抗原的負荷下，為防止于外來抗原導致的自身肝損傷，iNKT細胞通過下調TCR或者上調程序性死亡-1(programmed cell death-1，PD-1)受體的表達、促進其胞內信號分子泛素化、分泌抑制性細胞因子IL-10及TGFβ等途徑抑制機體免疫反應[21-22]，使正常的肝臟呈現免疫耐受狀態(tài)，從而維持正常肝內免疫平衡，以保證肝臟在不斷的細胞因子刺激下免受損傷。此外，研究[23]表明，CXCR6/CXCL16的相互作用不僅是肝臟免疫識別反應的重要基礎，也是iNKT細胞介導的維持免疫耐受，減少組織損傷的前提。由此可見肝臟的解剖及功能結構、iNKT細胞在微環(huán)境中與其他細胞復雜的相互作用共同創(chuàng)造了肝內特殊微環(huán)境，這種微環(huán)境決定了健康肝臟和炎癥之間的平衡?，F已有研究[24]表明，肝內免疫失調是肝臟疾病發(fā)生的標志，免疫細胞的數量、分化及功能狀態(tài)均與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關，而iNKT細胞可以通過多種途徑維持肝內免疫穩(wěn)態(tài)，由此推斷iNKT細胞的變化與肝內疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關。例如，Kaneko等[25]證實iNKT細胞可以上調細胞表面FasL的表達，促進穿孔素、顆粒酶及TNFα釋放并誘導肝細胞死亡，加重自身免疫肝炎的肝組織損傷，而Vα14NKT表達缺陷可以減輕對肝臟的損傷；由于飲酒過度激活iNKT細胞，導致細胞因子大量釋放及炎性細胞的聚集，加劇了肝組織損傷及肝細胞死亡[26]，促進了酒精性肝病的進展，而iNKT缺陷小鼠的肝組織損傷程度明顯減緩[27]。盡管iNKT細胞活化在某些程度上可以加重肝組織損傷，但更多的研究證實iNKT細胞還具有抗炎和保護肝臟的作用，例如在HBV/HCV感染的肝炎過程中，活化的iNKT細胞通過分泌IFNγ，抑制HBV/HCV在肝細胞內的復制，發(fā)揮抗病毒作用[28-29]；此外，HCC是肝臟各類疾病進展的最終結局，研究表明iNKT細胞的數量與功能障礙與HCC的發(fā)生、發(fā)展有關，Zahran等[30]通過流式細胞術證明HCC患者中外周血iNKT細胞表達頻率較正常人群明顯降低，且肝癌組織iNKT細胞數量及分泌IFNγ的功能顯著低于癌旁組織[31]，Xiao等[32]證實肝腫瘤的iNKT細胞和IFNγ表達是HCC復發(fā)的獨立預測因子，iNKT細胞減少會顯著增加腫瘤轉移風險，而iNKT細胞的增加則會減弱這種轉移概率[18,30]，提示iNKT細胞在抗HCC中發(fā)揮著重要的免疫調節(jié)作用。

3 iNKT細胞在HCC中抗腫瘤的作用機制

HCC通常繼發(fā)于病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等炎癥性肝病，是危害人類健康最嚴重的癌癥之一。由于HCC惡性程度高并且發(fā)現時多數已為晚期，手術(切除、消融)及靶向藥物等治療很難阻止疾病進展，目前已有研究支持活化的iNKT細胞對腫瘤微環(huán)境的多種免疫細胞具有重要的調控作用，且這種復雜作用的結局將導致對HCC細胞的殺傷作用。最初，Miyagi等[33]發(fā)現在HCC小鼠體內通過α-GalCer直接誘導iNKT細胞活化，可以增加NK細胞對肝內腫瘤的殺傷作用。但后來人們發(fā)現，腫瘤患者的iNKT細胞對α-Galcer的反應比正常人群低，體內直接誘導iNKT增殖并活化存在一定缺陷[34]。于是Margalit等[35]通過在體外擴增iNKT細胞并回輸給肝細胞癌小鼠，觀察到血清IFNγ、IL-12及IL-4顯著升高，外周血CD8+T淋巴細胞表達升高，腫瘤生長受到抑制。研究學者[36]也在其他腫瘤中證實了iNKT細胞可以通過逆轉免疫抑制性的微環(huán)境中NK細胞及CD8+T淋巴細胞活性，間接殺傷MHC陰性或者陽性的腫瘤細胞，大大增加了體內的抗腫瘤活性。

研究[37]表明，HCC患者抗腫瘤免疫反應低下除了因為NK、CD8+T淋巴細胞衰竭外，往往還伴隨著免疫抑制性細胞，如MDSC及腫瘤相關巨噬細胞的富集和抑制性免疫檢查點，如PD-1及其配體PD-L1等上調抑制了機體抗腫瘤免疫反應。iNKT細胞除了逆轉NK及CD8+T淋巴細胞活性外，還可以在免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境中拯救MDSC對T淋巴細胞的抑制程度[38]，促使MDSC表型發(fā)生改變(CD11b表達下降，CD86表達升高)，減弱MDSC的抑制作用，并且可能增加抗原遞呈細胞的作用達到抗腫瘤效果[39]。此外，Hix等[40]在動物實驗中證明Vα14 NKT 細胞還可以通過CD1d依賴方式識別并殺傷腫瘤相關巨噬細胞，從多方面抑制腫瘤生長，發(fā)揮抗腫瘤作用。

目前，隨著抗PD-1單克隆抗體廣泛用于原發(fā)性肝癌臨床治療，大部分患者漸漸出現耐藥，Bae等[41]發(fā)現iNKT細胞的活化能夠在抗PD-1耐藥模型中顯著抑制腫瘤生長，逆轉免疫抑制抗腫瘤藥物位點耐藥，為耐藥患者的治療帶來了希望。這也為iNKT細胞聯合抗PD-1藥物治療HCC提供了可能。此外，嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的發(fā)展進一步擴展了iNKT細胞在腫瘤領域的應用，因為研究表明具有共刺激結構域的CAR能促進iNKT細胞分泌Th1型細胞因子，并且增加其發(fā)揮抗腫瘤能力的持久性[42]。CAR-iNKT細胞治療可以彌補CAR-T在治療HCC中的不足[43]：(1)滲透性弱，不能有效地歸巢肝臟；(2)受到MDSC及PD-1表達等塑造的免疫抑制微環(huán)境影響不能有效發(fā)揮作用；(3)未利用NK細胞的殺傷活性，“一拳難敵四手”?；趇NKT細胞的免疫治療恰好可以改善這種問題，能從恢復NK細胞、T淋巴細胞活性及干擾免疫抑制性細胞雙方面糾正HCC固有的免疫功能低下，恢復機體細胞毒性細胞功能。雖然在HCC研究方面，相關文獻報道仍較少，但總之，iNKT細胞可以從多方面改善HCC微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，從而增加機體抗腫瘤活性。

4 結語

綜上所述，iNKT細胞具有強大的免疫調節(jié)特性，是肝臟免疫系統的參與者與守護者，不僅對調節(jié)正常肝臟的免疫反應具有重要意義，也在各類肝臟疾病中發(fā)揮重要的調控作用，尤其能夠在肝臟抗腫瘤免疫中逆轉CD8+T淋巴細胞、NK細胞衰竭，并且對腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性細胞具有負性調節(jié)作用，這為HCC的治療提供了新方向。然而關于iNKT細胞的研究大多數均來自動物模型實驗，尚需更多的臨床研究。且該免疫療法采用自體回輸，其治療效果取決于多重因素，包括iNKT細胞亞群功能，體外擴增數量，注射劑量、頻率及個體中腫瘤微環(huán)境差異等，因此在研究中需要考慮到以下幾點：(1)人類中的iNKT細胞表型多變，功能也很豐富，如何使其在發(fā)揮抗腫瘤過程中加強分泌Th1型細胞因子，或者找出其中一個具有更長發(fā)揮時效的iNKT細胞亞群以達到更好的治療效果；(2)iNKT細胞的組織特異性分布原因尚且不清楚，是否可以從了解組織分布特異性機制方面去找出一種利于iNKT細胞向肝臟遷移的基因，利用攜帶這種基因的iNKT細胞實現精準靶向治療使其更具療效：(3)雖然有證據表明iNKT細胞可以自然遷移到肝臟中，但尚無有力證據表明iNKT細胞可以遷移到肝臟腫瘤細胞表面，是否可以通過制備靶向腫瘤抗原的iNKT細胞精準實現抗腫瘤免疫。這些均需要在研究中進行不斷探索，相信通過不斷優(yōu)化iNKT細胞回輸的條件，該免疫治療是實現成功的抗HCC免疫最具前景的治療方式。

作者貢獻聲明：胡想金負責文章寫作思路并撰寫論文;高耀負責修改論文; 閭軍負責指導并最后定稿。