受體酪氨酸激酶Axl及其配體Gas6與肝細(xì)胞癌的關(guān)系

吳 雨，錢平安，范興良，祝峻峰

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院 肝病科，上海 201203

肝細(xì)胞癌(HCC)是目前我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿、發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，被公認(rèn)為重大疑難疾病[1]。在肝癌進(jìn)展中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在轉(zhuǎn)移的早期階段起關(guān)鍵作用。EMT賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，包括干細(xì)胞特征、減少凋亡，促進(jìn)免疫抑制，不僅在發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，并且參與癌癥的發(fā)生過(guò)程。受體酪氨酸激酶Axl與EMT密切相關(guān)，直接影響間質(zhì)狀態(tài)并賦予其侵略性表型，在EMT介導(dǎo)的致癌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制Axl可逆轉(zhuǎn)EMT。在肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中，Axl結(jié)合支架蛋白14-3-3ζ是TGFβ1介導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展的必要條件[2]。故靶向抑制Axl成為腫瘤治療的新策略[3]。

1 Gas6/Axl在肝臟中的生物學(xué)特性

1.1 受體與配體 Axl是一種酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinases，RTK)，屬于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)家族，由Tyro-3、Axl和Mer組成。TAM受體包含兩個(gè)免疫球蛋白樣(Ig)結(jié)構(gòu)域，其胞外結(jié)構(gòu)域中包含兩個(gè)纖連蛋白3型(FNⅢ)部分，激酶結(jié)構(gòu)域中包含保守氨基酸序列KW(I/L)A(I/L)ES[4]。人類Axl基因位于染色體19q13.2上，由20個(gè)外顯子編碼，形成由894個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Axl被翻譯后糖基化形成120 kD(部分糖基化形式)或140 kD的蛋白質(zhì)。Gas6和ProS是TAM的配體，其中Gas6與Axl的親和力最高，而ProS主要與Tyro3和Mer結(jié)合Axl通過(guò)維生素K翻譯修飾后具有生物活性[5]。

Gas6介導(dǎo)的Axl二聚化分兩步進(jìn)行，首先Axl免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域與Gas6的層狀蛋白G樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得Gas6與Axl以1∶1的比例連接，形成高親和力的Gas6/Axl復(fù)合物，而后這種復(fù)合物橫向擴(kuò)散，形成Axl同源二聚體化復(fù)合物[6]。Axl可介導(dǎo)細(xì)胞增殖，依賴于MAPK/ ERK途徑，并涉及PI3K和c-Jun-N-JNK的激活。Ras、Twist和NF-κB是Axl的下游靶標(biāo)[7]。微環(huán)境因素(例如缺氧)激活A(yù)xl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以驅(qū)動(dòng)血管生成[8]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)-1和HIF-2可結(jié)合到小鼠體內(nèi)Axl近端啟動(dòng)子的缺氧反應(yīng)元件上，導(dǎo)致HCC中Axl的轉(zhuǎn)錄激活[9]。Axl的另一個(gè)上游調(diào)節(jié)劑是RAB10，在HCC患者中其與腫瘤大小和晚期腫瘤的分期有關(guān)[10]。在HCC進(jìn)展中，Axl由Hippo/YAP信號(hào)上調(diào)和誘導(dǎo)，增強(qiáng)了肝腫瘤的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移作用[11]。

1.2 Gas6/Axl在HCC中的作用 Axl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常會(huì)引起炎癥、自身免疫性疾病和癌癥[6]。Gas6/Axl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有助于腫瘤細(xì)胞在凋亡刺激的應(yīng)答中存活[6,12]。Axl及配體Gas6浸潤(rùn)在由腫瘤細(xì)胞、脈管系統(tǒng)、白細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞組成的腫瘤微環(huán)境中[13]。在HCC中，Gas6/Axl信號(hào)通路可通過(guò)激活slug促進(jìn)腫瘤侵襲[14]。同時(shí)，Axl也是EMT和化學(xué)抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。在HCC中，由于TGFβ的協(xié)同作用，肝腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷EMT、Axl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲/轉(zhuǎn)移[2]。在這個(gè)過(guò)程中，Gas6/Axl與支架蛋白14-3-3ζ結(jié)合后激活JNK，JNK通過(guò)Smad3接頭區(qū)域的異常磷酸化和促轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄，將TGFβ轉(zhuǎn)換為腫瘤進(jìn)展功能基因。

2 Gas6/Axl信號(hào)通路與HCC的EMT過(guò)程

2.1 EMT與HCC EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理或病理?xiàng)l件下失去上皮特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種生物現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為細(xì)胞遷移性和侵襲性、誘導(dǎo)干細(xì)胞特性等。EMT是可逆的，其反向過(guò)程被稱為MET[16]。根據(jù)組織環(huán)境或激活信號(hào)，在EMT的過(guò)程中，上皮細(xì)胞可能失去部分特征，存在中間狀態(tài)(EMTed)，具有上皮和間充質(zhì)表型的屬性，并且還表現(xiàn)出干細(xì)胞樣的特性，顯示出高度的可塑性，并在癌癥發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[17]。腫瘤內(nèi)存在自我更新的干細(xì)胞樣細(xì)胞，稱為“腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)” ，EMT過(guò)程使癌細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中擴(kuò)散和自我更新，分化的癌細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并產(chǎn)生致癌突變，通過(guò)EMT過(guò)程整合到腫瘤干細(xì)胞中[18]。在許多類型的癌癥中，干細(xì)胞已經(jīng)通過(guò)表觀遺傳程序與EMT表型聯(lián)系起來(lái)。同樣，HCC中也出現(xiàn)具有EMT/MET類型的腫瘤干細(xì)胞。在腫瘤侵襲前的HCC患者樣本中，觀察到具有間充質(zhì)表型的干細(xì)胞[19]。有研究[20]用免疫組化法檢測(cè)27例HCC患者上皮細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)63%的患者上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，81%的患者上皮細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)，78%的患者CSC標(biāo)記CD13上調(diào)，表明EMT可以促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與HCC的預(yù)后和治療有著密切的關(guān)系[21]。

2.2 Axl與HCC的EMT過(guò)程 大多數(shù)腫瘤靶向治療是通過(guò)抑制RTK或其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[22]。Axl是屬于RTK家族的跨膜糖蛋白，最初從慢性髓細(xì)胞白血病患者中分離得到。正常生理?xiàng)l件下，Axl表達(dá)于包括大腦在內(nèi)的各種器官中，參與間質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[23]。而在腫瘤進(jìn)程中，Axl的過(guò)表達(dá)與腫瘤患者的生存率相關(guān)，可在多種類型的癌癥中檢測(cè)到[4]。已發(fā)現(xiàn)Axl的過(guò)表達(dá)與多種癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[24]。癌癥中的Axl信號(hào)參與上皮細(xì)胞真核轉(zhuǎn)化[25]，其中極化的上皮細(xì)胞失去其連接完整性，變成能動(dòng)的、侵襲性的間充質(zhì)細(xì)胞[26]。在643種人類癌細(xì)胞系中，檢測(cè)到Axl表達(dá)升高與間充質(zhì)表型呈正相關(guān)[27]。

在EMT的過(guò)程中，Axl是EMT的重要下游調(diào)節(jié)劑，是許多惡性腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的必需條件[25,28]。而在HCC的EMT過(guò)程中，Axl是腫瘤侵襲的決定因素[2,14]，在這個(gè)過(guò)程中，基因表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄因子Slug調(diào)控，Snail和Twist賦予腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，并通過(guò)E-cadherin抑制及Vimentin過(guò)表達(dá)達(dá)到侵襲和轉(zhuǎn)移的目的[29]。敲除Axl可導(dǎo)致間充質(zhì)HCC細(xì)胞喪失侵襲和內(nèi)皮遷移的能力，以及上皮性HCC細(xì)胞失去由于Axl過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移能力[2]。HCC細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與EMT相關(guān)，TGFβ在早期腫瘤發(fā)展過(guò)程中具有抑制腫瘤的作用，但在晚期，肝腫瘤細(xì)胞可通過(guò)拮抗細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和細(xì)胞毒性作用誘導(dǎo)EMT，激活晚期HCC中TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致HCC的進(jìn)一步發(fā)展[30]。Reichl等[2]發(fā)現(xiàn)Axl信號(hào)是TGFβ介導(dǎo)HCC進(jìn)展的關(guān)鍵，Axl信號(hào)導(dǎo)致Smad3L的異常磷酸化、前轉(zhuǎn)移靶基因的誘導(dǎo)以及TGFβ的分泌增加，進(jìn)而激活TGFβ的促腫瘤靶基因、纖溶酶原激活物抑制劑1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和Snail。

2.3 Gas6/Axl信號(hào)通路與HCC的EMT過(guò)程 Axl的致癌潛能在酪氨酸激酶域內(nèi)，可通過(guò)結(jié)合配體Gas6，激活其酪氨酸激酶活性，進(jìn)而活化下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的增殖、黏附和轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[31]。此過(guò)程中Gas6/Axl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必須與14-3-3ζ結(jié)合，并作用于下游信號(hào)。14-3-3ζ蛋白參與各種細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)成分結(jié)合[32]，其與靶標(biāo)之間的相互作用主要由結(jié)合蛋白的磷酸化介導(dǎo)。在HCC中，可觀察到14-3-3ζ的過(guò)表達(dá)[33]，14-3-3ζ在復(fù)合αB-晶狀體蛋白中誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的EMT發(fā)生[34]。14-3-3ζ充當(dāng)Gas6/Axl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的支架蛋白，siRNA對(duì)14-3-3ζ的干擾減弱了間充質(zhì)3sp細(xì)胞以及過(guò)表達(dá)Axl的3sp細(xì)胞中Gas6/Axl依賴性的遷移和侵襲反應(yīng)，表明Axl必須與14-3-3ζ相互結(jié)合激活下游信號(hào)[2]。由Gas6/Axl激活的下游途徑包括PI3K/Akt途徑[35]、MAPK/ERK途徑[36]和Ral GTPase蛋白途徑[37]。

在HCC的EMT過(guò)程中，有多條信號(hào)通路起作用，包括RTK通路、TGFβ通路Wnt通路以及Hedgehog通路等。TGFβ通路被認(rèn)為是參與EMT過(guò)程中最具影響力的信號(hào)通路。典型的TGFβ信號(hào)通路被激活后，三個(gè)亞型之一(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)與TGFβ受體Ⅱ(TGFβRⅡ)結(jié)合，激活TGFβ受體Ⅰ，形成TGFβRⅡ/Ⅰ異源二聚體，進(jìn)一步啟動(dòng)下游多個(gè)信號(hào)通路，包括依賴Smads的通路和非依賴Smads的通路。在腫瘤環(huán)境下，依賴Smads通路調(diào)節(jié)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括Snail、Slug、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、Twist等，通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫抑制及EMT的發(fā)生等，增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)HCC進(jìn)展中發(fā)生EMT時(shí)，Gas6/Axl/14-3-3ζ信號(hào)激活JNK，磷酸化TGFβ通路中Smad3連接區(qū)的絲氨酸-123殘基，促進(jìn)TGFβ靶基因如PA1、MMP9和Slug的上調(diào)，以及間充質(zhì)HCC細(xì)胞中TGFβ1分泌的增加，導(dǎo)致間充質(zhì)HCC的侵襲性表型增強(qiáng)[2]。敲除Axl或14-3-3ζ可消除Smad3L磷酸化的影響。

3 Axl在HCC診斷中的應(yīng)用

早期HCC的準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒別診斷可以顯著提高患者的生存率，目前在臨床實(shí)踐中HCC的檢測(cè)主要通過(guò)診斷成像技術(shù)和血清生物標(biāo)志物的測(cè)定，代表的血清標(biāo)志物是AFP。然而在HCC的早期階段，AFP的靈敏度僅為18%～60%，特異度有限。因此，一些其他的生物標(biāo)記已被用來(lái)補(bǔ)充和增加HCC檢測(cè)的準(zhǔn)確性，其中最常用的是去-γ-羧基凝血酶原、AFP-L3、骨橋蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和高爾基蛋白-73[38]。但關(guān)于這些標(biāo)志物性能的報(bào)道是相互矛盾的，Meta分析[39]顯示，去-γ-羧基凝血酶原和AFP-L3的表現(xiàn)都不如AFP。

Axl通過(guò)其配體Gas6與胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合被激活，導(dǎo)致下游靶標(biāo)的磷酸化，胞外結(jié)構(gòu)域可被MMP處理，釋放出一種可在血清中檢測(cè)到的80 kD可溶性蛋白(sAxl)[40]。因此在一項(xiàng)涉及中國(guó)和歐洲患者的多中心研究[41]中，討論了sAxl作為HCC非侵入性生物標(biāo)志物的潛力，對(duì)311例HCC患者的血清進(jìn)行了分析。根據(jù)BCLC標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為極早期、早期和晚期HCC。與健康或肝硬化對(duì)照者相比，在所有的HCC患者 (18.575 ng/ml)、極早期的HCC患者(18.064 ng/ml)和早期的HCC患者 (16.430 ng/ml)中發(fā)現(xiàn)了顯著增加的sAxl水平，在HCC晚期，觀察到sAxl水平進(jìn)一步上升(18.880 ng/ml)，表明在各期HCC患者血清中均可檢測(cè)到sAxl的水平明顯增加。并且在極早期的AFP陰性患者中，sAxl顯示出更高的靈敏度(80%)和特異度(69.2%)。在HCC與肝硬化的鑒別診斷中，sAxl (AUC=0.815)也優(yōu)于AFP (AUC=0.771)，并且與AFP (55.3%)相比顯示出更高的敏感度(78%)。在患有乳腺癌、卵巢癌或結(jié)腸直腸癌的患者中，sAxl水平并沒(méi)有變化，從而證明了sAxl作為HCC生物標(biāo)志物的特定作用。結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移不會(huì)改變sAxl的血清水平，因此可以區(qū)分HCC和繼發(fā)性的肝臟惡性腫瘤?？傊?，與單用AFP相比，sAxl在檢測(cè)HCC的早期階段顯示出了較高的靈敏度。sAxl和AFP的結(jié)合進(jìn)一步提高了診斷效率，并在HCC和肝硬化的鑒別診斷中顯示出較高的準(zhǔn)確性。此外，sAxl在AFP陰性的HCC患者中表現(xiàn)良好。因此sAxl是篩選早期HCC的潛力候選生物標(biāo)志物之一。

4 Axl及其抑制劑在HCC治療中的應(yīng)用

Axl與多種惡性腫瘤分子靶向治療獲得性耐藥的發(fā)展有關(guān)，也是抗血管生成藥和多靶點(diǎn)激酶抑制劑適應(yīng)性耐藥的關(guān)鍵[42]。Axl及其主要配體Gas6在許多人類癌癥(如肺癌、乳腺癌和胰腺癌)中過(guò)度表達(dá)和活化，并與不良預(yù)后、促進(jìn)侵襲性/轉(zhuǎn)移、EMT表型和耐藥性相關(guān)。在不同的模型系統(tǒng)中單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合，使用特定的小分子激酶抑制劑或抗體來(lái)靶向Axl，可導(dǎo)致Axl介導(dǎo)的信號(hào)通路失活，重新獲得藥物敏感性和提高治療效果，因此將Axl定義為癌癥治療的有希望的新靶點(diǎn)。Pinato等[43]使用R428測(cè)試了Axl抑制的細(xì)胞毒性潛力，R428是一種Axl特異性小分子抑制劑，在體內(nèi)外均具有抗腫瘤功效。使用SRB分析，證實(shí)在連續(xù)暴露于藥物72 h后，R428在一組HCC細(xì)胞系的微摩爾范圍內(nèi)發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用。由于R428是一種選擇性的具有Axl抑制特性的酪氨酸激酶抑制劑，利用細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力等實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)基因下調(diào)和R428的藥理學(xué)抑制，對(duì)Axl進(jìn)行治療性調(diào)節(jié)，可影響HCC的進(jìn)展。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Axl是多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑的主要調(diào)節(jié)因子，推測(cè)Axl磷酸化可能在機(jī)制上參與了索拉非尼耐藥性的發(fā)生。R428對(duì)索拉非尼具有誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制和促凋亡潛能的增量效應(yīng)，使得Axl抑制劑在晚期HCC一線治療上具有一定的開發(fā)前景，在患者因肝功能障礙或癥狀性進(jìn)展而面臨無(wú)法治療之前，延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期。

5 展望

在HCC中，Gas6/Axl軸過(guò)度表達(dá)/過(guò)度激活可導(dǎo)致其進(jìn)展，包括影響侵襲、轉(zhuǎn)移、化療以及靶向抗癌的治療，表明Gas6/Axl通路是潛在的癌癥治療靶點(diǎn)。對(duì)于這條通路的抑制可以通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用Axl酪氨酸激酶抑制劑、靶向Axl/MET/EGFR界面的藥物及其下游信號(hào)效應(yīng)子，或者通過(guò)使用針對(duì)Gas6和Axl的阻斷抗體。已有多家藥物公司正在進(jìn)行多種抑制劑的臨床開發(fā)，這些抑制劑或是專門針對(duì)Axl，或者是針對(duì)Axl的具有良好效力的多靶點(diǎn)激酶抑制劑[44]。

Axl在HCC診斷中的前景，體現(xiàn)在其釋放的可溶性蛋白sAxl可作為HCC早期診斷的標(biāo)志物。sAxl的水平反應(yīng)肝臟疾病的進(jìn)展過(guò)程，對(duì)患者進(jìn)行分層，利于HCC和肝硬化的鑒別，表明Axl和sAxl有作為精確診斷HCC標(biāo)志物的潛力。在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，EMT促進(jìn)HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，而Axl作為EMT的重要下游調(diào)節(jié)劑，是腫瘤侵襲的決定性因素。目前對(duì)于Axl活化在HCC發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等多個(gè)方面的研究取得了一些進(jìn)展。但仍需解決一些問(wèn)題，如Axl抑制在阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用之外如何影響癌癥免疫？Axl/Gas6抑制劑通過(guò)什么機(jī)制發(fā)揮抗癌作用？由于Axl在癌癥發(fā)生、侵襲/轉(zhuǎn)移/EMT和耐藥性等背景中的作用，在臨床研究中，需要結(jié)合特定情況，仔細(xì)評(píng)估這些因素。隨著對(duì)Gas6/Axl信號(hào)通路研究的不斷深入，其可為HCC的早期診斷和治療提供新的思路，而其在腫瘤EMT中的作用機(jī)制和對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，不僅為抗HCC治療提供新的研究方向，也可推及至其他類型的腫瘤，為進(jìn)一步研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)聲明：吳雨擬定寫作思路，撰寫論文及修改；錢平安、范興良參與資料收集；祝峻峰指導(dǎo)文章修改。