肝細(xì)胞癌早期診斷中的生物標(biāo)志物

劉熙稱，王藝穎，童曼曼，秦俊杰

吉林大學(xué)第一醫(yī)院 a.肝膽胰內(nèi)科, b.急診內(nèi)科，長春 130021

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤和第四大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，主要在病毒性肝炎、酒精和代謝相關(guān)脂肪性肝病等引起的慢性炎癥和纖維化的背景下發(fā)生[2]，其 5年生存率常低于20%[3]。由于目前的生物標(biāo)志物早期診斷HCC困難，因此大多數(shù)患者一旦被診斷即為晚期，并(或)伴有肝內(nèi)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊咭巡贿m合接受治愈性治療(切除或移植)，姑息性治療成為唯一選擇[4]。由此可見，HCC的早期診斷顯得尤為重要。目前，血清AFP檢測(cè)是一種常用且重要的早期診斷HCC的方法，但其低敏感度和特異度限制了診斷效能[5]。因此，迫切需要開發(fā)新的早期診斷方法提高HCC檢出率，并能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)歸，從而提高患者的治愈率和生存率。

1 傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物

1.1 甲胎蛋白(AFP) AFP于20世紀(jì)60年代首次被引入作為HCC的血清學(xué)標(biāo)志物[6]，因其檢測(cè)簡(jiǎn)單易行且便于篩查，是當(dāng)前我國診斷HCC和監(jiān)測(cè)療效的常用指標(biāo)[7]。一項(xiàng)針對(duì)5581例HBV感染者的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明[8]，AFP的半年篩查方案可提高HCC檢出率，但腫瘤更早的檢出并不能降低病死率。此外，直徑小于2 cm的病變，AFP很少升高。AFP的固有缺點(diǎn)是在妊娠、慢性或活動(dòng)性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤以及其他消化道腫瘤中也可升高。即使使用低水平的臨界值(即10～20 ng/ml)，AFP診斷HCC的敏感度約為60%，特異度約為90%[9]。因此，美國肝病學(xué)會(huì)實(shí)踐指導(dǎo)委員會(huì)不再推薦AFP用于HCC的早期檢測(cè)[10]。目前，已開發(fā)出許多候選標(biāo)志物用于HCC篩查及診斷[11]，如AFP異質(zhì)體(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、脫-γ-羧基-凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、Dickkopf-1 (DKK1)、血清鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)及SCCA-IgM和高爾基體糖蛋白73(Golgi protein-73，GP73)。我國學(xué)者推薦，對(duì)于血清AFP陰性人群可借助AFP-L3、DCP和血漿游離微小RNA(microRNA,miRNA)進(jìn)行早期檢測(cè)，提高其診斷效能[7]。

1.2 AFP聯(lián)合其他血清生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值 HCC是由多種危險(xiǎn)因素引起的具有多種致病機(jī)制的復(fù)雜疾病，因此很難用單一生物標(biāo)志物進(jìn)行診斷。雖然AFP作為一種生物標(biāo)志物在HCC篩查中有其局限性，但與其他血清標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，可提高HCC診斷的敏感度和特異度。Choi等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)由689例肝硬化和/或慢性乙型肝炎(CHB)患者組成的前瞻性研究，通過分析AFP、AFP-L3和DCP的受試者工作特征曲線下面積(AUC)，發(fā)現(xiàn)AFP聯(lián)合AFP-L3可顯著提高HCC早期診斷的效能(AUC=0.83)。Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AFP結(jié)合ALT、AST和中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比對(duì)HBV相關(guān)HCC的診斷性能優(yōu)于單一生物標(biāo)志物或其他組合，其診斷方程可作為區(qū)分HBV-HCC與CHB的有用工具。

2 新型的生物標(biāo)志物

2.1 乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg) CHB可能會(huì)發(fā)展為肝硬化和HCC，因此，在具有高病毒復(fù)制活性或晚期纖維化的高?；颊咧蓄A(yù)測(cè)HCC的發(fā)展非常重要。HBcrAg與血清HBV DNA和肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)相關(guān)[14]。一項(xiàng)大型隊(duì)列研究[15]表明，血清HBcrAg水平預(yù)測(cè)未經(jīng)治療的CHB患者發(fā)生HCC的能力明顯優(yōu)于HBV DNA。一項(xiàng)針對(duì)2666例慢性HBV感染者(基因型B或C)的長期隨訪研究[16]發(fā)現(xiàn)，HBcrAg水平是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。值得關(guān)注的是，HBcrAg水平為10 KU/ml時(shí)，可以識(shí)別出具有高HCC風(fēng)險(xiǎn)的中等病毒載量患者。Suzuki等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBcrAg值的組合是評(píng)估HCC風(fēng)險(xiǎn)的極佳生物標(biāo)志物。

2.2 液體活檢 液體活檢標(biāo)本包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTC)或凋亡細(xì)胞或活細(xì)胞釋放形式的遺傳信息。無細(xì)胞核酸可以在體液中自由循環(huán)或被胞外小泡(如外泌體)吸收。癌細(xì)胞釋放到循環(huán)中的無細(xì)胞核酸被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[18-19]。Xu等[20]在HCC組織中鑒定出與健康個(gè)體的血液白細(xì)胞相比呈差異富集的ctDNA甲基化標(biāo)志物組，研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)基于甲基化模式的標(biāo)記組在HCC診斷中的敏感度和特異度分別為85.7%和94.3%。因此，從外周血樣本中鑒定出的HCC甲基化的變化特征，也有可能作為診斷HCC的生物標(biāo)記[19]。另有研究[21]報(bào)道，HCC患者外周血中所有類型的CTC數(shù)量均明顯大于非惡性肝病患者(P<0.05)?？侰TC在診斷HCC方面比AFP更有效(AUC=0.821，95%CI：0.756～0.886)，聯(lián)合使用總CTC和AFP可以增強(qiáng)診斷HCC的敏感度。Li等[22]通過建立健康個(gè)體和癌癥患者的大規(guī)模血液細(xì)胞外囊泡長鏈RNA(extracellular vesicle long RNA，exLR)圖譜，發(fā)現(xiàn)了基于exLR的液體活檢在癌癥診斷中的作用。其中，8個(gè)exLRs可以作為診斷HCC的生物標(biāo)志物，具有很高的診斷效能(AUC=0.952 7,95%CI：0.917 0～0.988 3)。exLR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)在于不僅可以區(qū)分開癌癥患者與健康個(gè)體，而且還可以確定腫瘤的起源。此外，還能通過靶向測(cè)序輕松地檢測(cè)出特異性RNA標(biāo)記，這意味著未來可作為常規(guī)且經(jīng)濟(jì)高效的診斷方法。

2.3 外泌體 研究[23]表明，血清外泌體中信使 RNA (mRNA)、miRNA、長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)等均可充當(dāng)HCC篩查和監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。由AFP和外泌體miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122及miRNA-200a構(gòu)成的組合被認(rèn)為是一種早期診斷HCC(AUC=0.993)更好的策略[24]。HCC患者血清外泌體miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-222及miRNA-224水平明顯高于CHB和肝硬化患者，但HCC患者血清相關(guān)miRNA水平與CHB和肝硬化患者相比差異較小。因此，血清外泌體miRNA能更好地用于HCC的診斷及預(yù)后評(píng)估[25]。此外，HCC患者血清外泌體lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635水平也顯著高于肝硬化、CHB患者和健康受試者[26]。用這兩種lncRNA和AFP組合篩查CHB中的HCC比單獨(dú)使用AFP檢測(cè)具有更高的敏感度和特異度。Xu等[27]通過檢測(cè)HCC、肝硬化和CHB患者以及健康受試者血清外泌體異型核糖核蛋白H1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1, hnRNPH1)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)用外泌體hnRNPH1 mRNA篩查CHB中的HCC(AUC=0.865)，敏感度和特異度分別可達(dá)85.2%和76.5%，特別是與AFP(≥20 ng/ml)聯(lián)合使用可進(jìn)一步提高診斷效能。

3 潛在的生物標(biāo)志物

3.1 微小RNA(miRNA) 理想的HCC生物標(biāo)志物應(yīng)有高敏感度及特異度，檢測(cè)費(fèi)用少且無創(chuàng)，并能夠在易于獲取的組織(如血清、血漿、尿液、唾液等)中進(jìn)行評(píng)估。miRNA具有高度穩(wěn)定性且以無細(xì)胞形式在血液甚至唾液中循環(huán)，可作為潛在的較少侵入性或非侵入性生物標(biāo)志物[28]。早先有研究[29]證實(shí)，血清miRNA-122是一種肝特異性miRNA，用其作為區(qū)分HCC患者和健康者的生物標(biāo)志物(AUC=0.869)，靈敏度和特異度分別為81.6%和83.3%，故可作為一種診斷HCC的潛在標(biāo)志物。另外，血清miRNA-16、miRNA-195、miRNA-199a、miRNA-143和miRNA-215也都可作為區(qū)分HCC患者和健康個(gè)體的重要生物標(biāo)志物，具有良好的敏感度和特異度[30]。

由于HCC是一種復(fù)雜的、具有多致病因素和高度異質(zhì)性的疾病，在其發(fā)生和發(fā)展過程中出現(xiàn)許多miRNA表達(dá)失調(diào)。因此，多個(gè)循環(huán)miRNA組合檢測(cè)能夠提供更高的特異度和敏感度，可作為HCC早期診斷的生物標(biāo)志物。研究[31]表明，7個(gè)血漿miRNA(miRNA-122、miRNA-192、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-26a、miRNA-27a和miRNA-801)組合可區(qū)分HCC與健康個(gè)體(AUC=0.941)、CHB(AUC=0.842)和肝硬化患者(AUC=0.884)，能顯著提高HCC診斷準(zhǔn)確性，在診斷早期HCC中具有重要臨床價(jià)值。Jin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者相比正常對(duì)照組有12種血漿miRNA表達(dá)始終上調(diào)，其中4種(miRNA-1972、miRNA-193a-5p、miRNA-214-3p和miRNA-365a-3p)明顯增加，但在非HCC患者中未見顯著升高，故可作為診斷HCC的生物標(biāo)志物，其中miR-1972的診斷性能最佳，具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。An等[33]還發(fā)現(xiàn)一組可作為診斷HCC潛在生物標(biāo)志物，即血清miR-375、miR-10a、miR-122和miR-423，AUC為0.995(95%CI：0.985～1)。

3.2 長鏈非編碼(lncRNA) 與其他腫瘤生物標(biāo)志物相比，lncRNA具有時(shí)間和組織特異性表達(dá)模式，可為臨床上區(qū)分患者和健康個(gè)體提供新的標(biāo)記。因此，lncRNA有望成為診斷癌癥的潛在生物標(biāo)志物[34-35]。關(guān)于lncRNA CDKN1A反義DNA損傷激動(dòng)RNA啟動(dòng)子 (promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA, PANDAR)、尿路上皮癌相關(guān)因子1 (urothelial carcinoma associated 1, UCA1)、漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1 (plasmacytoma variant translocation gene 1, PVT1)、HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA (HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)在HCC早期診斷中的潛在價(jià)值已有相關(guān)研究報(bào)道[36]。一項(xiàng)納入80例HCC患者及同期50例健康受試者的對(duì)照研究[37]發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清lncRNA癌癥易感性候選物9(cancer susceptibility candidate 9, CASC9)表達(dá)水平明顯增加，AUC為0.933。而CASC9能否成為診斷HCC的潛在標(biāo)志物，關(guān)鍵在于其能否區(qū)分開HCC與肝炎，目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。Qi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，HBV HCC患者血清lncRNA反義胰島素樣生長因子2 (insulin growth factor 2 antisense, IGF2AS)水平明顯高于健康受試者、慢性HBV和HBV相關(guān)性肝硬化患者，而且AFP陰性HCC患者和AFP陽性HCC患者血清IGF2AS水平均較HBV相關(guān)性肝硬化患者升高，提示血清IGF2AS可能是診斷HBV-HCC的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。李雙良等[39]研究顯示，lncRNA HOTAIR、H19和肝癌高度上調(diào)因子(highly upregulated in liver cancer, HULC)可作為診斷早期HBV-HCC的潛在標(biāo)志物，這三種lncRNA聯(lián)合診斷HCC的敏感度為91.67%，特異度為93.33%。

4 總結(jié)與展望

質(zhì)譜和下一代測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)步為鑒定HCC早期診斷的生物標(biāo)志物帶來了廣闊的前景和挑戰(zhàn)。首先，循環(huán)miRNA作為一類全新的生物標(biāo)志物，其敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的血清蛋白標(biāo)志物。由于體液中miRNA的某些變化在HCC早期就已較為明顯，因此便于監(jiān)測(cè)篩查早期HCC的發(fā)生。但是，體液中miRNA的變化可能會(huì)出現(xiàn)基于人群的差異，因此應(yīng)在大規(guī)模的臨床研究中驗(yàn)證其作為生物標(biāo)志物的能力。其次，外泌體囊泡中所含的蛋白質(zhì)、核酸和其他物質(zhì)存在于相對(duì)獨(dú)立的特殊環(huán)境中，比自由存在于組織或體液中的腫瘤標(biāo)志物具有更高的穩(wěn)定性和豐度。但目前關(guān)于外泌體的鑒定、分離和純化技術(shù)不成熟，分子機(jī)制不完全清楚以及外泌體的人工合成技術(shù)尚不成熟，因此，關(guān)于外泌體在HCC診斷方面的許多研究仍處于臨床前的實(shí)驗(yàn)階段。此外，lncRNA是近年來HCC研究領(lǐng)域一個(gè)新的熱點(diǎn)，但在其成為可用于臨床的生物標(biāo)志物之前，還需要進(jìn)行大量的深入研究?？傊M管有這些限制，但通過對(duì)這些新型的生物標(biāo)志物的研究，不僅可對(duì)HCC診斷提供重要的線索，而且還可為發(fā)掘出更好的治療策略開辟新的思路。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉熙稱負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫論文；劉熙稱、王藝穎、童曼曼參與文獻(xiàn)搜集，修改論文；秦俊杰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。