變異鏈球菌與白色念珠菌相互作用機(jī)制的研究進(jìn)展

孫國(guó)芳，胡 濤，郭 強(qiáng)

1國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔預(yù)防科，四川 成都 610041；2口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041

口腔是僅次于胃腸道的第二豐富的微生物群聚集地，人類口腔微生物群落擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫(kù)（eHOMD）顯示，口腔中包含約770個(gè)微生物物種信息［1］。這些微生物在口腔中定植、繁殖并通過(guò)復(fù)雜的相互作用在口腔微生態(tài)環(huán)境中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，而口腔疾病的發(fā)生大多與微生物之間相互作用的動(dòng)態(tài)平衡被打破有關(guān)［2］。變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和白色念珠菌（Candida albicans）分別是口腔的主要致齲細(xì)菌和主要致病真菌，對(duì)低齡兒童齲（early children caries，ECC）患齲部位的研究發(fā)現(xiàn)兩者的共同檢出率很高［3-5］，多項(xiàng)研究也集中揭示了兩種微生物之間存在著跨原核生物界-真核生物界的復(fù)雜相互作用。事實(shí)上，這種相互作用關(guān)系不僅影響了變異鏈球菌的致齲性，也影響了白色念珠菌在義齒性口炎中的致病性。本綜述對(duì)變異鏈球菌與白色念珠菌跨界相互作用對(duì)各自致病性的影響及相互作用機(jī)制進(jìn)行了回顧，并探討天然產(chǎn)物在調(diào)控變異鏈球菌與白色念珠菌雙菌種生物膜及其毒力特性方面的應(yīng)用。

1 變異鏈球菌與白色念珠菌的生物學(xué)特點(diǎn)與致病性

變異鏈球菌是革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，是人類口腔常駐菌之一，目前認(rèn)為，變異鏈球菌是人類齲病的主要致病菌［6］。變異鏈球菌對(duì)牙面具有強(qiáng)黏附能力，在發(fā)酵碳水化合物后產(chǎn)酸力強(qiáng)、產(chǎn)酸速度快，同時(shí)耐酸性非常強(qiáng)，有助于其在牙菌斑酸性的情況下持續(xù)不斷地產(chǎn)酸，增加致齲性；此外，變異鏈球菌可以通過(guò)葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）以蔗糖為底物合成多種胞內(nèi)多糖（intracellular polysaccharides，IPS）及胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS），為其貯存能量、提供對(duì)牙面的黏附位點(diǎn)并促進(jìn)牙菌斑成熟［7］。變異鏈球菌可以通過(guò)分泌一類被稱為密度感應(yīng)（quorum sensing，QS）信號(hào)分子的信號(hào)物質(zhì)來(lái)感知周圍環(huán)境的變化，從而調(diào)控自身行為以適應(yīng)復(fù)雜的口腔環(huán)境［8］。其QS信號(hào)分子分為兩類：種內(nèi)QS信號(hào)分子CSP（competence-stimulating peptide）和XIP（sigX-inducing peptide）；種間QS信號(hào)分子AI-2（autoinducer-2）；這些分泌到胞外的信號(hào)分子達(dá)到一定濃度后激活相應(yīng)的受體蛋白從而改變相應(yīng)基因的表達(dá)［9-11］。

白色念珠菌是口腔中常見的機(jī)會(huì)性致病真菌，在成人健康口腔中檢出率為30%～35%。該菌主要定植在口腔黏膜、矯治器等表面，在口腔中可引起白色念珠菌?。ㄈ缪┛诓。?、義齒性口炎等疾病。白色念珠菌具有酵母與菌絲兩種形態(tài)，生物膜的形成和毒力的表達(dá)通常與其從酵母形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)有關(guān)，生物膜的形成和水解酶的分泌被認(rèn)為是白色念珠菌的主要毒力因素［12］。法尼醇（fanesol）和酪醇（tyrosol）是白色念珠菌所分泌的QS信號(hào)分子［13］；法尼醇可以抑制白色念珠菌菌絲形成［14］，抑制生物膜形成，增強(qiáng)白色念珠菌抗藥性和氧化應(yīng)激能力等［15］。酪醇具有與法尼醇幾乎相反的作用，其可刺激白色念珠菌酵母細(xì)胞芽管形成［16］，在生物膜形成早期促進(jìn)白色念珠菌菌絲形成［17］。

2 變異鏈球菌與白色念珠菌跨界相互作用對(duì)致病性的影響

口腔中可能同時(shí)存在數(shù)量眾多的變異鏈球菌與白色念珠菌，已有研究提示兩者在共存狀態(tài)下可能影響各自的致病性，而變異鏈球菌與白色念珠菌的跨原核生物界-真核生物界相互作用應(yīng)該在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

研究表明在齲病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，白色念珠菌對(duì)變異鏈球菌的致齲作用產(chǎn)生一定的協(xié)同作用。Falsetta等［18］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)感染變異鏈球菌或白色念珠菌的動(dòng)物相比，共同感染兩種微生物的動(dòng)物其牙菌斑中檢出的變異鏈球菌和白色念珠菌的數(shù)量均顯著增加（分別超過(guò)3倍、20倍）。此外，變異鏈球菌與白色念珠菌共同感染的動(dòng)物其光滑面齲壞的進(jìn)展更加迅速，整體齲壞也更加嚴(yán)重，表明兩種微生物很可能發(fā)生協(xié)同作用增強(qiáng)了牙菌斑生物膜的致齲性［18］。事實(shí)上，多位學(xué)者的研究均證實(shí)ECC患兒其唾液和牙菌斑中白色念珠菌和變異鏈球菌的共同檢出率與齲齒的嚴(yán)重程度存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系［5，19-20］。

白色念珠菌是義齒性口炎的主要致病菌，但是在義齒表面形成的牙菌斑中，除真菌外還有許多細(xì)菌，可能在義齒性口炎的發(fā)生過(guò)程中存在一定作用［21］。Valentini等［22］發(fā)現(xiàn)，義齒性口炎的患者和未患有義齒性口炎的人群在佩戴活動(dòng)義齒7 d后，前者基托表面的牙菌斑中變異鏈球菌的檢出率要顯著高于后者。Barbosa等［23］的研究也表明，與變異鏈球菌共培養(yǎng)有助于白色念珠菌形成生物膜，然而，加入變異鏈球菌的培養(yǎng)液上清卻會(huì)減少白色念珠菌生物膜的細(xì)胞數(shù)量、抑制菌絲生長(zhǎng)。通過(guò)構(gòu)建白色念珠菌大蠟螟（Galleria mellonella）感染模型并注射變異鏈球菌細(xì)胞或者培養(yǎng)液上清，他們進(jìn)一步證實(shí)變異鏈球菌可在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中減弱白色念珠菌的致病毒力，從而提高模型動(dòng)物的生存率［23］。變異鏈球菌與白色念珠菌相互作用對(duì)義齒性口炎發(fā)病的影響仍然有待進(jìn)一步研究。

3 跨界相互作用對(duì)變異鏈球菌的影響機(jī)制

3.1 導(dǎo)致變異鏈球菌基因表達(dá)譜的改變

變異鏈球菌在與白色念珠菌進(jìn)行雙菌種生物膜共培養(yǎng)時(shí)，其基因表達(dá)譜發(fā)生明顯改變。與變異鏈球菌單菌種生物膜相比，雙菌種生物膜狀態(tài)顯著改變了變異鏈球菌393個(gè)基因的表達(dá)，大多上調(diào)了與碳水化合物運(yùn)輸和代謝/分解相關(guān)的基因［24］。KEGG通路分析表明雙菌種共培養(yǎng)提高了變異鏈球菌丙酮酸鹽和半乳糖的代謝，提示共培養(yǎng)增強(qiáng)了變異鏈球菌對(duì)碳水化合物的利用［24］。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction system，TCSTS）對(duì)變異鏈球菌響應(yīng)外界環(huán)境刺激，調(diào)控自身毒力基因表達(dá)具有重要作用［25］。研究發(fā)現(xiàn)，雙菌種生物膜狀態(tài)下變異鏈球菌的多個(gè)TCSTS轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)生變化，CiaRH TCSTS的基因ciaR、ciaH上調(diào)了2倍，而ComDE TCSTS（也是QS調(diào)控系統(tǒng)）信號(hào)肽CSP的編碼基因comC及其他晚期感受態(tài)基因comYB、comYD、comEA及comEC下調(diào)［24］。QS常常涉及一系列基因表達(dá)的調(diào)控與變化，至于變異鏈球菌哪些基因涉及響應(yīng)其與白色念珠菌的相互作用則有待深入研究。

3.2 影響變異鏈球菌生長(zhǎng)及胞外多糖的產(chǎn)生

研究表明，變異鏈球菌-白色念珠菌共培養(yǎng)形成生物膜影響前者的生長(zhǎng)。Kim等［26］提取雙菌種生物膜形成早期（18 h）的培養(yǎng)液上清用于變異鏈球菌培養(yǎng)，48 h后發(fā)現(xiàn)該上清液會(huì)明顯促進(jìn)變異鏈球菌的生長(zhǎng)。兩菌共培養(yǎng)狀態(tài)下的相互作用對(duì)變異鏈球菌胞外多糖產(chǎn)生也有影響。2014年，Sztajer等［27］通過(guò)掃描電鏡觀察培養(yǎng)10 h的變異鏈球菌-白色念珠菌雙菌種生物膜，發(fā)現(xiàn)其胞外多糖較變異鏈球菌單菌種生物膜減少，進(jìn)一步以綠色熒光染料標(biāo)記胞外多糖，熒光顯微鏡觀察證實(shí)雙菌種生物膜綠色熒光明顯弱于變異鏈球菌單菌種生物膜的綠色熒光，表明雙菌種生物膜早期的相互作用可能抑制變異鏈球菌產(chǎn)生胞外多糖。然而，幾乎在同一時(shí)間，F(xiàn)alsetta等［18］通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀測(cè)雙菌種生物膜三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)相比單菌種生物膜，變異鏈球菌-白色念珠菌的雙菌種生物膜生長(zhǎng)到42 h后可以極大增強(qiáng)EPS的聚集導(dǎo)致其雙菌種生物膜更厚。2017年，Ellepola等［28］使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌與白色念珠菌共培養(yǎng)48 h時(shí)會(huì)產(chǎn)生豐富的葡聚糖（EPS的主要成分）。這些不同時(shí)間點(diǎn)的觀察結(jié)果表明，變異鏈球菌與白色念珠菌在雙菌種生物膜狀態(tài)下不同時(shí)期的相互作用對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)生胞外多糖具有不同的影響。

3.3 增強(qiáng)變異鏈球菌的黏附

白色念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)組成。有研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌分泌的β-1，3葡聚糖為變異鏈球菌分泌的一種GTF（GtfB）提供結(jié)合位點(diǎn)［28］，其他研究也發(fā)現(xiàn)雙菌種生物膜狀態(tài)下白色念珠菌細(xì)胞壁外表面的甘露聚糖可介導(dǎo)GtfB結(jié)合［29］。GtfB黏附在白色念珠菌的表面，并以蔗糖為底物原位產(chǎn)生葡聚糖，從而有助于變異鏈球菌EPS的聚集［30］。原位產(chǎn)生的葡聚糖又可以增加變異鏈球菌的連接位點(diǎn)，極大地增強(qiáng)變異鏈球菌和白色念珠菌的相互黏附［18］。使用原子力顯微鏡觀查發(fā)現(xiàn)雙菌種狀態(tài)下，GtfB與白色念珠菌形成穩(wěn)定而牢固的結(jié)合［29］；白色念珠菌和其表面黏附的GtfB通過(guò)連接鍵的伸展、斷裂而發(fā)生解離，而變異鏈球菌和其表面黏附的GtfB通過(guò)連接鍵的斷裂發(fā)生解離（無(wú)伸展過(guò)程），所以相比于變異鏈球菌表面的GtfB，黏附到白色念珠菌表面的GtfB與白色念珠菌之間的黏附力更強(qiáng)，黏接更穩(wěn)定［31］。

3.4 白色念珠菌QS信號(hào)分子法尼醇的跨界作用

法尼醇是白色念珠菌產(chǎn)生的QS信號(hào)分子，研究發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌也能響應(yīng)法尼醇的刺激，高濃度法尼醇（＞100 μmol/L）會(huì)抑制其生長(zhǎng)，但是在低濃度時(shí)（25 μmol/L、50 μmol/L）則表現(xiàn)出促進(jìn)變異鏈球菌生長(zhǎng)、增強(qiáng)Gtfs活性的作用，并且這種作用具有濃度依賴性［26］。進(jìn)一步的研究顯示，變異鏈球菌與白色念珠菌共同培養(yǎng)時(shí)，法尼醇在亞抑菌濃度（0.78 mmol/L、1.56 mmol/L）下，可顯著降低變異鏈球菌的產(chǎn)酸性，但是不影響白色念珠菌的水解酶活性；激光共聚焦掃描顯微鏡顯示，法尼醇在抑菌濃度下（3.12 mmol/L、12.50 mmol/L），變異鏈球菌-白色念珠菌雙菌種生物膜的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，表現(xiàn)為活細(xì)胞和胞外基質(zhì)的減少［32］。QS信號(hào)分子法尼醇對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)和毒力的影響與法尼醇的濃度有關(guān)系，這也提示了前文提到的雙菌種相互作用與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，不同的培養(yǎng)時(shí)間分泌到胞外的QS信號(hào)分子濃度不同。

4 跨界相互作用對(duì)白色念珠菌的影響機(jī)制

4.1 影響白色念珠菌多個(gè)毒力基因的表達(dá)

變異鏈球菌-白色念珠菌共培養(yǎng)時(shí)也會(huì)影響白色念珠菌的基因表達(dá)。Ellepola等［28］研究表明，變異鏈球菌分泌的GtfB會(huì)促進(jìn)白色念珠菌多個(gè)與生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，包括菌絲壁蛋白（hyphal wall protein，HWP1）、凝集素樣序列（agglutinin-like sequences，ALS1）和ALS3基因。而Lobo等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，相比于白色念珠菌單菌種生物膜，變異鏈球菌-白色念珠菌雙菌種生物膜會(huì)顯著抑制BGL2（胞外基質(zhì)產(chǎn)生相關(guān)）、PHR1（胞外基質(zhì)和耐酸相關(guān)）和SOD1（氧化應(yīng)激相關(guān)）基因的表達(dá)。Ellepola等［33］基于RNA測(cè)序和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示變異鏈球菌與白色念珠菌相互作用時(shí)，白色念珠菌與碳水化合物代謝相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，涉及糖轉(zhuǎn)運(yùn)、有氧呼吸、丙酮酸分解和乙醛酸循環(huán)；其他與細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞壁成分（如甘露聚糖和葡聚糖）直接或間接相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)也被上調(diào)。

4.2 變異鏈球菌QS信號(hào)分子CSP的跨界作用

白色念珠菌菌絲相的轉(zhuǎn)變可以由變異鏈球菌產(chǎn)生的QS信號(hào)分子CSP所抑制。Jarosz等［34］觀察到，變異鏈球菌培養(yǎng)4 h的上清液會(huì)抑制白色念珠菌出芽，而培養(yǎng)6、8、24 h的上清液則無(wú)此現(xiàn)象。為了確定變異鏈球菌在生長(zhǎng)早期產(chǎn)生的CSP的作用，他們構(gòu)建了不能產(chǎn)生CSP的變異鏈球菌comC基因缺失突變株，并添加1 μmol/L人工合成的CSP重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加CSP的突變株上清液抑制效果與野生株上清液相似，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，添加0.01、0.10、1.00 μmol/L CSP到變異鏈球菌comC突變株菌液均可抑制白色念珠菌芽管的形成，且抑制效果具有濃度依賴性，表明變異鏈球菌產(chǎn)生的QS信號(hào)分子CSP對(duì)白色念珠菌的出芽乃至向菌絲相的轉(zhuǎn)變有影響，然而CSP對(duì)白色念珠菌生物膜的生物量并沒有作用［34］。變異鏈球菌另一種QS信號(hào)分子XIP對(duì)白色念珠菌的作用目前并不清楚，有待進(jìn)一步研究。

5 作用于變異鏈球菌與白色念珠菌雙菌種生物膜的天然產(chǎn)物的研究探索

變異鏈球菌與白色念珠菌在共同形成生物膜的過(guò)程中存在復(fù)雜的相互作用，可能影響各自毒力特性的表達(dá)。在應(yīng)用天然產(chǎn)物控制變異鏈球菌與白色念珠菌雙菌種生物膜及其毒力方面，有一些學(xué)者進(jìn)行了探索，目前以多酚類天然產(chǎn)物的研究最具代表性。

多酚類具有抗氧化、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)等多種作用。Farkash等35］研究表明，綠茶多酚（polyphenol from green tea，PPFGT）和從藏藥中提取的酚類PH均可以抑制變異鏈球菌與白色念珠菌雙菌種生物膜的形成和葡聚糖分泌，但是不影響其浮游生長(zhǎng)，在PPFGT濃度為0.625 mg/mL、PH濃度為0.16 mg/mL時(shí)抑制效果最佳。另一項(xiàng)研究表明，從蔓越橘中提取的多酚類對(duì)變異鏈球菌與白色念珠菌的雙菌種生物膜的毒力具有抑制作用。與對(duì)照組相比，在雙菌種生物膜培養(yǎng)液中加入濃度為500～1 000 μg/mL的蔓越橘提取物可以顯著抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸耐酸能力、EPS分泌、生物膜結(jié)構(gòu)［36］。丁子香酚是另一種酚類，可以由丁香油、樟腦油等中提取，研究顯示，丁子香酚在亞抑菌濃度下（100 μg/mL）可以顯著抑制雙菌種生物膜形成，與對(duì)照組相比，形成生物膜的量為52.65%，同時(shí)掃描電鏡顯示雙菌種生物膜的分布被打亂［37］。多酚類天然產(chǎn)物眾多，結(jié)構(gòu)各異，在篩選對(duì)變異鏈球菌和白色念珠菌的雙菌種生物膜有作用的天然產(chǎn)物方面尚有很大的空間。

6 總結(jié)和展望

在口腔細(xì)菌與真菌相互作用的相關(guān)研究中，主要致齲細(xì)菌變異鏈球菌與口腔主要機(jī)會(huì)性致病真菌白色念珠菌因?yàn)樵诘妄g兒童齲ECC中常共同檢出，成為跨界相互作用研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)變異鏈球菌與白色念珠菌發(fā)生相互作用影響致病性，凸顯了進(jìn)一步研究?jī)烧呦嗷プ饔玫木唧w機(jī)制與信號(hào)調(diào)控通路的重要性?，F(xiàn)有的研究大多關(guān)注變異鏈球菌與白色念珠菌相互作用對(duì)各自毒力特性與毒力基因表達(dá)的影響。作為遺傳背景完全不同的兩種微生物，細(xì)菌與真菌在相互作用過(guò)程中其QS信號(hào)分子的跨界作用也同樣值得關(guān)注與進(jìn)一步探索。有關(guān)變異鏈球菌與白色念珠菌的多種QS信號(hào)分子在雙菌種生物膜狀態(tài)下起到何種作用以及相應(yīng)的作用機(jī)制，尚有大片空白有待深入研究。在研究變異鏈球菌與白色念珠菌相互作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，篩選更多具有抑制作用的天然產(chǎn)物，可為臨床干預(yù)兩者相互作用、控制其致病性提供更多選擇。