銅離子對大菱鲆幼魚的急性毒性

師皓晨 萬玉美 孫桂清 趙海濤 崔兆進(jìn) 吳彥 陳秀玲

摘 要：在水溫（15±2）℃條件下采用靜水生物測試法，研究Cu2+脅迫對體重（8.19±1.47）g，體長（6.0±04）cm的大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼魚的急性毒性。研究結(jié)果表明：隨水中Cu2+濃度的升高，大菱鲆幼魚表現(xiàn)出更多顯著的急躁狂游、抬頭頻繁、跳躍、鰓蓋起伏劇烈和分泌黏液等應(yīng)激行為，隨脅迫時間增加，大菱鲆幼魚的死亡率顯著升高。Cu2+對大菱鲆幼魚的48 h、72 h和96 h半數(shù)致死濃度（LC50）分別為2926、1.733和1.221 mg/L。安全質(zhì)量濃度（SC）為0.122 1 mg/L。暴露時間為48 h、72 h和96 h回歸方程分別為y=2.065 x+4.037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3和y= 8.745 9 x+4.243。Cu2+對大菱鲆幼魚屬于中等毒性物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：大菱鲆;急性毒性;Cu2+;LC50;SC

我國大菱鲆（Scophthalmus maximus）工廠化養(yǎng)殖規(guī)模居全球之首[1]，主要養(yǎng)殖地區(qū)集中在渤海灣的三省一市，即河北省、山東省、遼寧省和天津市，而渤海灣是目前我國收納污染物最多的海域，且渤海灣海水中的重金屬含量超出平均水平24倍[2]。王宏偉等[3]報道在天津渤海灣4種重金屬的分布及生態(tài)風(fēng)險評價中，Cu2+污染顯著增加，表明測試區(qū)域的水體中具有潛在危害，可能對當(dāng)?shù)孛舾形锓N產(chǎn)生影響。

目前，Cu2+對水生生物的脅迫作用研究在蝦、蟹、魚類等已取得一定的成果，如克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、中華鱘（Acipenser sinensis）等，研究主要涵蓋急性毒性、行為、生理生化和分子水平等方向。關(guān)于魚類暴露于Cu2+的研究主要有Cu2+脅迫下魚類的急性毒性和行為方面。宋波瀾等[4]研究表明隨水體中Cu2+濃度升高中華鱘幼魚在水中表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，如出現(xiàn)呼吸頻率降低、擺尾次數(shù)增加等異常生理現(xiàn)象。秦華偉等[5]研究表明，受到Cu2+脅迫的褐牙鲆（Paralichtys olivaceus）出現(xiàn)焦躁不安、狂游、跳躍、鰓蓋起伏劇烈、體表分泌大量黏液和痙攣等異常生物行為現(xiàn)象。

然而，目前尚沒有關(guān)于海水養(yǎng)殖過程中Cu2+脅迫對大菱鲆幼魚急性毒性的研究，為此，本試驗以大菱鲆幼魚為試驗對象，研究Cu2+脅迫下大菱鲆幼魚的中毒癥狀和急性毒性效應(yīng)，并獲得Cu2+對大菱鲆幼魚的半數(shù)致死濃度（LC50）和安全濃度，為大菱鲆的工廠化養(yǎng)殖及水質(zhì)的評判和檢測提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用的大菱鲆幼魚購于河北省半滑舌鰨良種場，體重（8.19±1.47）g，體長（6.0±0.4）cm。挑選大小均等、體表無傷痕、體質(zhì)健康強(qiáng)壯的幼魚進(jìn)行試驗研究。試驗前進(jìn)行7天暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間水溫（15±2）℃。持續(xù)24 h通氣，每天換水兩次并及時清除池內(nèi)的糞便及殘餌。日投飼量為試驗魚體重的1.78%，分兩次投喂。在試驗開始的前一天停止喂食。

1.2 試驗方法

急性毒性試驗采用靜水試驗的生物測試法，在試驗期間不對試驗液進(jìn)行更換。試驗于養(yǎng)殖車間的聚乙烯塑料水族箱中進(jìn)行，光照周期為自然光，保證每個水族箱所處環(huán)境相同。試驗用沙濾池過濾海水，水溫為（15±2）℃，24 h充氧，保證試驗水體溶氧含量正常。

1.2.1 急性毒性預(yù)試驗 通過預(yù)試驗對藥液質(zhì)量濃度的大致范圍進(jìn)行確定，預(yù)試驗水體量以魚的負(fù)荷1 g魚/L水計算[6]，共使用82 L水。預(yù)試驗濃度梯度設(shè)置4組，分別為0.1、1.0、10.0、1000 mg/L，每組設(shè)置3個平行。按照濃度從低到高的順序?qū)⒋罅怫矣佐~移入已配置好的濃度組中[7]，每個濃度組放入10尾大菱鲆幼魚。試驗中連續(xù)觀察96 h，并于每6 h檢查并且準(zhǔn)確記錄大菱鲆幼魚的死亡情況。在幼魚中毒后，使用玻璃棒輕觸幼魚尾部，如無反應(yīng)則判斷為死亡并將死魚及時清出[6]。

第一次預(yù)試驗結(jié)束后，根據(jù)大菱鲆幼魚的死亡情況設(shè)置第二次預(yù)試驗，縮小正試驗的濃度范圍。設(shè)置5組濃度梯度，分別為0.5、1.0、2.0、40、8.0 mg/L。每個濃度組放入10尾大菱鲆幼魚，并設(shè)置3個平行。連續(xù)觀察96 h，每隔6 h檢查大菱鲆幼魚死亡情況，準(zhǔn)確統(tǒng)計并計算大菱鲆幼魚在不同濃度梯度下的死亡概率。

1.2.2 急性毒性正試驗 正式試驗的濃度梯度根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果按等對數(shù)等比級數(shù)設(shè)置6個質(zhì)量濃度，分別為1.00、1.26、1.58、2.00、2.51、3.16 mg/L組和對照組0 mg/L，每組15尾大菱鲆幼魚，并設(shè)置3個平行。每6 h檢查魚的生存情況，撈出死魚準(zhǔn)確統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并在試驗過程中觀察存活大菱鲆幼魚的行為和中毒癥狀。在將死魚撈出后觀察其中毒死亡的癥狀，并對死魚進(jìn)行解剖，觀察其內(nèi)臟及鰓在Cu2+脅迫后發(fā)生的變化。全部試驗過程中不換水、不投飼，在發(fā)現(xiàn)水族箱底部有糞便沉淀時使用抄網(wǎng)撈起。

1.2.3 半數(shù)致死濃度（LC50）和安全質(zhì)量濃度（SC） 利用概率單位圖解法求Cu2+脅迫對大菱鲆幼魚的半數(shù)致死濃度（LC50）。將大菱鲆幼魚死亡率轉(zhuǎn)化為死亡率的概率單位作為縱坐標(biāo)，Cu2+的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為濃度對數(shù)作為橫坐標(biāo)，并由計算得到其回歸方程和R2值。將48 h、72 h和96 h死亡率為50%，即其概率單位等于5作為y值代入回歸方程，即可求出48 h、72 h和96 h的LC50。

計算LC50的95%置信區(qū)間公式：

lgLC5095%的置信區(qū)間=lgLC50±1.96×2S2N

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)差，N為概率單位在4和6范圍之內(nèi)的各組試驗生物的總數(shù)。得出lgLC50后求其反對數(shù)，就可得到LC50的95%置信區(qū)間[7]。

安全質(zhì)量濃度的計算公式[8]為：

SC=96 h LC50×0.1

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+脅迫下大菱鲆幼魚的癥狀及行為

大菱鲆幼魚在不同濃度處理組中表現(xiàn)出不同的中毒行為，見表1。在低濃度處理組中大菱鲆幼魚受到刺激后的活動情況與對照組基本相似，會迅速抬頭在水族箱內(nèi)游動，遇到水族箱壁后靈活轉(zhuǎn)彎，并在游動過后平穩(wěn)沉入水族箱底部，有體表黏液分布增多現(xiàn)象。隨著脅迫時間增加，大菱鲆幼魚在受刺激后會出現(xiàn)急躁狂游的中毒癥狀。高濃度處理組的大菱鲆幼魚受刺激后大多表現(xiàn)出上升到水面沿池壁迅速轉(zhuǎn)圈急躁狂游、上下抬頭、跳躍、鰓蓋起伏劇烈、遇水族箱壁未能靈活轉(zhuǎn)彎或直接碰壁，幼魚體表和鰓都分泌出大量黏液，暴露時間增長后魚體表開始出現(xiàn)體表充血的現(xiàn)象。

隨著暴露時間的增長，高濃度處理組的大菱鲆幼魚活動能力開始減弱，受刺激時反應(yīng)遲鈍，多次刺激后才出現(xiàn)反應(yīng)。部分幼魚腹部朝上，體表深色斑紋褪色并出現(xiàn)白色塊狀色斑，鰓蓋翹起，口大幅張開，部分魚腹部出現(xiàn)充血，身體僵硬死亡。幼魚中毒死亡個體鰓出現(xiàn)腫脹并伴有顏色加深的現(xiàn)象，部分幼魚鰓絲上附著藍(lán)色絮狀物。部分大菱鲆幼魚體表和鰓蓋上出現(xiàn)了淺綠色的沉淀。Cu2+中毒的大菱鲆幼魚在解剖后，發(fā)現(xiàn)其肝臟較對照組幼魚腫大，膽囊腫大并充滿膽汁，部分魚在解剖時出現(xiàn)腸脹氣，并在試驗過程中的水體中出現(xiàn)白便現(xiàn)象。

2.2 Cu2+脅迫下大菱鲆幼魚死亡率

不同濃度的Cu2+在不同暴露時間的死亡率情況見表2。在相同的Cu2+濃度組中，大菱鲆幼魚的死亡率隨暴露時間的增長而增長。在不同濃度組中，相同時間觀測點大菱鲆幼魚死亡率隨Cu2+濃度升高而升高。在48 h時，質(zhì)量濃度為0、1.00、1.26? mg/L的處理組中，大菱鲆幼魚的死亡率為0;質(zhì)量濃度為1.58、2.51、3.16 mg/L的處理組中，大菱鲆幼魚開始出現(xiàn)死亡。在96 h時，質(zhì)量濃度為2.51 mg/L和3.16 mg/L的處理組中，大菱鲆幼魚全部死亡。0 mg/L濃度組中，大菱鲆幼魚未出現(xiàn)死亡。

2.3 Cu2+脅迫對大菱鲆幼魚的LC50和SC

Cu2+脅迫48 h、72 h和96 h，大菱鲆幼魚死亡率的概率單位與濃度對數(shù)呈明顯的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為y=2.065 x+4037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3和y= 8.745 9 x+4243，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.969 9、0.920 9和0.987 2，均大于0.9，說明數(shù)據(jù)有效性強(qiáng)。伴隨Cu2+濃度對數(shù)增加，48 h、72 h和96 h，大菱鲆幼魚死亡概率平穩(wěn)上升。

Cu2+脅迫下，大菱鲆幼魚48 h、72 h和96 h的半數(shù)致死濃度（LC50）和安全質(zhì)量濃度（SC）見表3。研究表明，大菱鲆幼魚的48 h、72 h和96 h的 LC50分別是2.926、1.733和1.221 mg/L;95%置信區(qū)間分別為2.134～4.011、1503～1998 mg/L和1133～1.315 mg/L。體重（8.19±1.47）g，體長（6.0±0.4）cm的大菱鲆幼魚養(yǎng)殖水體中Cu2+的安全質(zhì)量濃度（SC）為0.122 1 mg/L。

3 討論

3.1 Cu2+對大菱鲆幼魚的急性毒性和毒性分級

在對重金屬離子污染安全進(jìn)行評價的過程中，污染重金屬的毒性和對于魚類行為的影響十分重要。但由于不同物種對于Cu2+的耐受能力不同，會造成不同物種對Cu2+的敏感性存在很大差異[9]。如Cu2+對澳洲龍紋斑（Maccullochella Peelii peelii）幼魚的SC為0.122 3 mg/L[10]。Cu2+對褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚的SC為0.097 5 mg/L[11]。中華鱘（Acipenser sinensis Gray）幼魚的SC為0.002 mg/L[12]。在本研究中，Cu2+對大菱鲆幼魚SC為0.122 1 mg/L。所以各種經(jīng)濟(jì)魚類對于Cu2+脅迫的敏感存在很大差異。大菱鲆幼魚的SC遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中所要求的Cu2+最高容許質(zhì)量濃度（0.01 mg/L）。所以相比于大多數(shù)的經(jīng)濟(jì)魚類，大菱鲆幼魚對Cu2+脅迫的耐受性較強(qiáng)。

在試驗過程中相同觀測時間點時，隨水體中Cu2+濃度的升高，大菱鲆幼魚死亡率明顯升高。根據(jù)相關(guān)資料報道，養(yǎng)殖水體中Cu2+的毒性受溫度、水體pH值和硬度等因素的影響比較大[13]，與淡水魚類相比，海水魚類對于Cu2+的耐受性和安全質(zhì)量濃度都比淡水魚高，造成這種現(xiàn)象的原因可能是海水中含有懸浮物、有機(jī)物、鎂離子、鈣離子等可以降低Cu2+毒性的物質(zhì)，使Cu2+對大菱鲆幼魚的安全質(zhì)量濃度得到提高。

3.2 Cu2+對大菱鲆幼魚行為的影響及癥狀分析

大菱鲆幼魚在含有Cu2+的水體中都出現(xiàn)了體表黏液增加，但隨著Cu2+濃度的升高，幼魚開始出現(xiàn)急躁狂游、抬頭頻繁、跳躍、鰓蓋起伏劇烈、幼魚體表和鰓分泌出大量黏液的現(xiàn)象。在對死魚進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，魚鰓出現(xiàn)腫脹并伴有顏色加深，肝臟較對照組幼魚肝臟明顯腫大。

鰓作為硬骨魚類呼吸和進(jìn)行氣體交換的場所，對水體中的重金屬離子反應(yīng)敏感。根據(jù)相關(guān)報道，Cu2+對鰓的毒性分為兩點：一是Cu2+會阻塞硬骨魚鰓絲與水體的接觸，使魚類的呼吸和氣體交換受到抑制;二是Cu2+會誘導(dǎo)硬骨魚鰓發(fā)生淋巴病變，并導(dǎo)致鰓的呼吸機(jī)能受到破壞[13]。而魚鰓在受水體重金屬離子脅迫后產(chǎn)生的病變則會對硬骨魚類的呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，嚴(yán)重時則會威脅魚類生存[14]。魚類的肝臟具有分解循環(huán)系統(tǒng)中有毒物質(zhì)的作用。有研究表明，重金屬Cu2+的中毒機(jī)理是：因為魚類體內(nèi)的Cu2+濃度超過了其生態(tài)閾值，使魚類肝臟內(nèi)抗氧化酶的活力降低，溶酶體膜磷脂發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致溶酶體膜發(fā)生破裂，釋放了大量溶酶體內(nèi)的水解酶，肝臟溶解性壞死，最終導(dǎo)致魚類死亡[15]。

4 結(jié)論

研究表明，大菱鲆幼魚Cu2+的96 h的半數(shù)致死濃度為1.221 mg/L，其Cu2+安全質(zhì)量濃度為0.122 1 mg/L，Cu2+對于大菱鲆幼魚的毒性應(yīng)屬于中等毒性物質(zhì)。

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Acute toxicity of copper ion on juvenile Scophthalmus maximus

SHI Haochen1， WAN Yumei1， SUN Guiqing2， ZHAO Haitao2， CUI Zhaojin2， WU Yan2， CHEN Xiuling3

（1. Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao 066000， China;2. Hebei Marine and Aquatic Science Research Institute， Qinhuangdao 066000， China;3. Administration of Ocean and Fisheries of Beidaihe New Area， Qinhuangdao， Qinhuangdao 066000， China）

Abstract：The acute toxicity of Cu2+ on juvenile Scophthalmus Maximus with body weight of （8.19±1.47） g and body length of （6.0±0.4） cm was studied by hydrostatic biological test at the water temperature （15±2）℃. The results showed that juvenile turbot exhibited more significant stress behaviors such as restless swimming， frequent head raising， jumping， severe fluctuation of gill lid and mucus secretion with the increase of Cu2+ concentration. The mortality of juvenile turbot increased significantly with the increase of stress time. The median lethal concentrations （LC50） of Cu2+ to juvenile turbot were 2.926， 1.733 and 1.221 mg/L at 48 h， 72 h and 96 h， respectively. Safety mass concentration （SC） was 0.122 1 mg/L. The regression equations of exposure time for 48 h， 72 h and 96 h were y=2.065 x+4.037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3 and y= 8.745 9 x+4.243， respectively. Cu2+ belongs to middle level toxicity substance to juvenile turbot.

Key words：Scophthalmus maximus;toxicity;Cu2+;LC50;SC

（收稿日期：2021-10-27）

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助 （CARS-47-Z02）;河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特色海產(chǎn)品創(chuàng)新團(tuán)隊海水魚崗專項經(jīng)費資助;農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項（20326701D）。

作者簡介：師皓晨（1996-），男，本科，研究方向：海水養(yǎng)殖技術(shù)。E-mail：2771736573@qq.com。

通信作者：趙海濤（1982-），男，高級工程師，研究方向：海水養(yǎng)殖技術(shù)。E-mail：ninan-tao@163.com。