紙橋法液體培養(yǎng)基替代瓊脂固體培養(yǎng)基用于食用菌菌種培養(yǎng)的初步探索

栗志

摘? ? 要：本文設計了一種使用紙橋法培養(yǎng)常見食用菌菌種（平菇、香菇、金針菇）的方案，并通過試驗得出如下結論：相對于瓊脂固體培養(yǎng)基，平菇、香菇、金針菇的菌絲體在紙橋法液體培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出更高的生長速率，而且紙橋法液體培養(yǎng)基在營養(yǎng)物質傳質速率方面存在顯著的優(yōu)勢，尤其適用于試驗教學，是瓊脂固體培養(yǎng)基的良好替代品。

關鍵詞：紙橋法;液體培養(yǎng)基;菌種培養(yǎng)

文章編號：1005-2690（2021）20-0017-02? ? ? ?中國圖書分類號：S646? ? ? ?文獻標志碼：B

紙橋法是傳統(tǒng)上用于植物組織培養(yǎng)的一種技術[1]，由于植物培養(yǎng)物對礦物鹽濃度較為敏感，瓊脂中額外的礦物質可能對植物培養(yǎng)物產(chǎn)生影響，故采用無灰濾紙制作的紙橋來確保培養(yǎng)物在不受到額外礦物質影響的情況下，也能夠給同時得到充分的氧氣、水分和營養(yǎng)物質供應[2]，另有原理和紙橋法類似的培養(yǎng)床網(wǎng)絨纖維用于愈傷組織液體培養(yǎng)基的傳質[3]。

實驗室規(guī)模的食用菌菌種培養(yǎng)一般采用PDA瓊脂固體培養(yǎng)基，相對于植物固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度（一般低于1%），真菌固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度（一般為2%）要高得多。瓊脂濃度越高，其分子構筑起的三維網(wǎng)狀凝膠結構的強度越大，這有助于固體培養(yǎng)基保持一定的強度和形狀，但也對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的遷移速率（即傳質速率）存在影響。以PDA培養(yǎng)基中的主要碳源和能源——葡萄糖為例，研究表明，瓊脂濃度的升高會造成葡萄糖的遷移速率減慢[4]。另有研究者發(fā)現(xiàn)由于存在傳質阻力，瓊脂濃度的增加會造成木葡糖酸醋桿菌的葡萄糖利用率、菌體量和細菌纖維素產(chǎn)量下降[5]。

嘗試用無灰濾紙制造的紙橋進行實驗室規(guī)模食用菌菌種培育，和相同營養(yǎng)成分的瓊脂固體培養(yǎng)基進行對照。根據(jù)菌種的生長速率和培養(yǎng)基中可溶性固形物（對應營養(yǎng)物質）的濃度變化來對比兩者培養(yǎng)方法的優(yōu)劣。

選用食用菌均為常見物種，即平菇、香菇、金針菇。

1? ?試驗準備

1.1? ?試驗材料

平菇（Pleurotus ostreatus）純培養(yǎng)菌種，品系為高郵3號;香菇（Lentinus edodes）純培養(yǎng)菌種，品系為L808;金針菇（Flammulina? velutiper）純培養(yǎng)菌種，品系為245號。

1.2? ?試驗設備及試劑

設備：人工氣候箱、干燥箱、高壓滅菌鍋、微孔濾膜透氣蓋和配套的螺口方玻璃瓶、解剖刀、鑷子、燒杯、量筒、電子天平、稱量紙、酒精燈、超凈工作臺、無灰濾紙。

試劑：新鮮的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDA）、去離子水、瓊脂粉。

2? ?試驗過程

將微孔濾膜透氣蓋和配套的螺口方玻璃瓶（橫截面積約為80 cm2）依照如下規(guī)則進行分組編號并處理。

瓊脂試驗組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后分別接種香菇純培養(yǎng)菌種、平菇純培養(yǎng)菌種、金針菇純培養(yǎng)菌種，每個菌種接種不少于4瓶，25 ℃、70%濕度黑暗培養(yǎng)。

紙橋試驗組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養(yǎng)基和無灰濾紙制造的紙橋，紙橋上表面盡可能和螺口方瓶橫截面大小、形狀一致，液面高度超過紙橋高度的2/3，保證整個紙橋被液體培養(yǎng)基所浸潤，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至常溫后分別接種香菇純培養(yǎng)菌種、平菇純培養(yǎng)菌種、金針菇純培養(yǎng)菌種，每個菌種接種不少于4瓶，25 ℃、70%濕度黑暗培養(yǎng)。

瓊脂對照組：加入組培瓶總容積1/4體積的PDA液體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

紙橋對照組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養(yǎng)基和無灰濾紙制造的紙橋，液面高度超過紙橋高度的2/3，保證整個紙橋被液體培養(yǎng)基所浸潤，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至常溫后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

瓊脂空白組：加入組培瓶總容積1/4體積的去離子水和液體重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

試驗過程中保持較高的濕度，一是模擬菌絲體最適宜生長的環(huán)境，二是通過提高水蒸氣分壓來減少培養(yǎng)基水分蒸發(fā)引起的誤差。瓊脂空白組的存在意義在于抵消瓊脂凝膠上層、下層瓊脂濃度不同造成的誤差。

每3 d記錄菌絲體在瓊脂試驗組和紙橋試驗組培養(yǎng)基上的生長狀況，30 d后對培養(yǎng)基取樣，在110 ℃干燥箱烘干至恒重，根據(jù)烘干后重量和烘干前重量的比值，計算出瓊脂試驗組、瓊脂對照組、瓊脂空白組上半層、下半層，以及紙橋試驗組和紙橋對照組液體培養(yǎng)基表層和深層的可溶性固形物含量。

3? ?試驗結果

3.1? ?菌絲體生長速率量化分析

對培養(yǎng)物進行拍照，將照片上紙橋上表面和瓊脂固體培養(yǎng)基表面劃分為5×5的25個小方格，最初接種的菌絲體大小控制在一個小方格左右，隨著時間推移，菌絲體不斷生長、擴散，覆蓋了越來越多的面積。利用小方格對菌絲體覆蓋面積進行計數(shù)，接近或略多于一個小方格全部面積的計為4%，接近或略多于一個小方格1/2面積的記為2%，覆蓋極少或根本沒有覆蓋一個小方格面積的記為0%。對菌絲體所占小方格的數(shù)量進行累加，即可判斷菌絲體的大小和生長速率。

經(jīng)過實測得到的3種食用菌菌絲體在紙橋和瓊脂表面的生長曲線（試驗組取平均值），其斜率即為生長速率，如圖1所示。

3.2? ?可溶性固形物含量分析

由于瓊脂培養(yǎng)基中的可溶性固形物數(shù)據(jù)包含瓊脂，所以需要將瓊脂空白組的可溶性固形物含量減去再作為有效數(shù)據(jù)。紙橋法有少量菌絲體蔓延到溶液中形成懸液，所以取樣后先過濾除去菌絲體再進行測定。

根據(jù)實測數(shù)據(jù)做出的30 d后平菇、香菇、金針菇培養(yǎng)基上（表）層/下（深）層可溶性固形物含量對比（試驗組取平均值，單位為%）結果如下。

瓊脂對照組：2.51/2.53，平菇瓊脂培養(yǎng)基：1.24/ 2.03，香菇瓊脂培養(yǎng)基：1.44/2.23，金針菇瓊脂培養(yǎng)基：1.34/2.09;紙橋法對照組：2.57/2.58，平菇紙橋法：1.56/1.58，香菇紙橋法：1.71/1.72，金針菇紙橋法：1.66/1.67。

4? ?結論與分析

平菇、香菇、金針菇菌絲體在紙橋法液體培養(yǎng)基上的生長速率普遍高于各自在瓊脂固體培養(yǎng)基上的生長速率，即菌絲體需要較短的時間即可占領同樣面積的培養(yǎng)基，這種特性適合在實驗室中進行教學，學生可以在較短的時間內(nèi)完成食用菌菌種培養(yǎng)的全過程。

平菇、香菇、金針菇菌種接種30 d后，瓊脂培養(yǎng)基上半部分的可溶性固形物（不包括瓊脂）含量顯著低于瓊脂固體培養(yǎng)基下半部分的可溶性固形物（不包括瓊脂）含量，而紙橋法液體培養(yǎng)基表層和深層的可溶性固形物含量十分接近，這一現(xiàn)象很好地表述出固體培養(yǎng)基在營養(yǎng)物質遷移速率上與液體培養(yǎng)基存在差距。用紙橋法培育食用菌菌種可以充分利用液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質較高的遷移速率，讓菌絲體得到更為充足的營養(yǎng)供應，不容易出現(xiàn)短缺現(xiàn)象，這可能是其表現(xiàn)出更高生長速率的原因之一。

紙橋法液體培養(yǎng)基為菌種培養(yǎng)提供了一條有效的新思路，但其具體參數(shù)的優(yōu)化，以及在規(guī)模上如何進一步擴大，從試驗室走向生產(chǎn)，仍需要更多的研究工作。

參考文獻：

[1]于德才，李學湛，呂典秋，等.紙橋法培育馬鈴薯脫毒試管苗壯苗技術初探[A]. 中國作物學會馬鈴薯專業(yè)委員會.2005年全國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)學術年會論文集[C].中國作物學會馬鈴薯專業(yè)委員會：中國作物學會馬鈴薯專業(yè)委員會，2005：2.

[2]安利國，楊桂文.細胞工程（3版）[M].北京：科學出版社，2015.

[3]周春長.影響植物纖維模擬生物反應器滲透浸潤傳質MS培養(yǎng)液過程的因素[D].吉首：吉首大學，2020.

[4]邊界，何田，葉微針，等.葡萄糖在瓊脂凝膠中的遷移速率[J].廣東化工，2021，48（7）：50-51.

[5]謝永振.靜置培養(yǎng)過程中瓊脂濃度對細菌纖維素合成的影響[D].天津：天津科技大學，2018.

（編輯：郝煥霞）