生物標(biāo)志物在特發(fā)性肺纖維化中的研究進(jìn)展

沈怡 李雅倩 胡曉燕 嚴(yán)辰希 陳學(xué)遠(yuǎn)

2.310015 浙江 杭州，杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種發(fā)病機(jī)制不明，慢性進(jìn)行性的纖維化肺部疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸困難、持續(xù)性干咳、限制性通氣功能障礙，最后因呼吸衰竭而死亡。近年來，隨著對IPF發(fā)病機(jī)制研究的深入，越來越多的細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)與IPF有關(guān)聯(lián)，已有提議將研究較為透徹的細(xì)胞因子作為IPF的生物標(biāo)志物，在評估疾病早期診斷、進(jìn)展、預(yù)后方面具有一定的意義[1]。但仍有新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子值得進(jìn)一步探索作為IPF潛在生物標(biāo)志物的價值。

生物標(biāo)志物

生物標(biāo)志物是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能改變或可能發(fā)生改變的生化指標(biāo)。生物標(biāo)志物已成為研究IPF的熱點之一，不斷有新的細(xì)胞因子被證實參與IPF，被認(rèn)為是IPF潛在的生物標(biāo)志物。近年來已從IPF患者的血液、支氣管肺泡灌洗液、肺組織等中檢測到多種生物標(biāo)志物，特別是從血液中獲取的生物標(biāo)志物因為其創(chuàng)傷性小，獲取方便，可連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點對應(yīng)用于臨床有較大的前景。

IPF的生物標(biāo)志物

一、MUC5B

黏蛋白5B(Mucin-5 subtype B，MUC5B)是一種由呼吸道淺表上皮細(xì)胞和黏膜下黏液腺細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型粘蛋白，主要是在呼吸道遠(yuǎn)端產(chǎn)生，其主要作用是黏液屏障保護(hù)，氣道黏液纖毛清除和氣道抗炎宿主防御[2]。研究發(fā)現(xiàn)MUC5B啟動子區(qū)域中rs35705950 G>T的單核苷酸多態(tài)性是IPF最強(qiáng)的遺傳危險因素，使遠(yuǎn)端氣道過度表達(dá)MUC5B，大量MUC5B蛋白沉積在微小蜂窩囊腫中[3]。Evans等[2]推測MUC5B過表達(dá)可能會使氣道中黏膜纖毛清除功能、宿主防御能力降低，導(dǎo)致空氣中的顆粒物質(zhì)的滯留引起肺損傷產(chǎn)生疤痕組織，持續(xù)的纖維增生引起肺纖維化。有研究表明，GG基因型的IPF患者在隨訪期間，能反映疾病預(yù)后的用力肺活量(Forced vital capacity，F(xiàn)VC)、一氧化碳彌散量(Carbon monoxide diffusing capacity，DLCO)和肺總量(Total lung capacity，TLC)變化程度較GT基因型大，死亡率也是GG基因型明顯高于GT基因型(χ2=29.069，P=0.02)[4]。MUC5B對肺功能的影響可預(yù)測IPF預(yù)后。

二、KL-6

Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原 (Krebs von den Lungen 6，KL-6)顧名思義是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌的一種大分子糖蛋白，KL-6也可由細(xì)支氣管上皮細(xì)胞分泌，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移、增殖，并抑制成纖維細(xì)胞的凋亡。KL-6被發(fā)現(xiàn)在IPF、結(jié)締組織相關(guān)性間質(zhì)性肺炎、過敏性肺炎、肺泡蛋白沉積癥等間質(zhì)性肺病中高表達(dá)[5]。有研究證實IPF、非特異性間質(zhì)性肺炎(Non-specific interstitial pneumonia，NSIP)支氣管肺泡灌洗液中的KL-6水平明顯高于健康對照組，兩組病例組KL-6水平均與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，但I(xiàn)PF與NSIP兩組的KL-6水平無顯著差異[6]。因此，KL-6不能將IPF與其他間質(zhì)性肺炎鑒別，作為IPF的診斷性生物學(xué)指標(biāo)存在爭議，但KL-6被認(rèn)為是評估IPF疾病活動進(jìn)展的重要標(biāo)志物。最近一項研究納入20例IPF患者，進(jìn)行為期1年的觀察，研究發(fā)現(xiàn)FVC<50%組的KL-6水平比FVC>50%組顯著增加；進(jìn)展期患者KL-6水平較非進(jìn)展期患者顯著升高[7]。

三、MMP-7

基質(zhì)金屬蛋白酶-7(Matrix metalloproteinase 7，MMP-7)主要在肺泡巨噬細(xì)胞以及肺組織的上皮細(xì)胞中表達(dá)，可降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的多種成分。目前研究提示MMP-7可作為潛在的IPF診斷生物標(biāo)志物，MMP-7在IPF患者的肺組織、血清、支氣管肺泡灌洗液中表達(dá)均較健康對照組顯著升高，并且當(dāng)血清MMP-7水平大于1.75 ng/mL時，可將IPF與NSIP、隱原性機(jī)化性肺炎、脫屑性間質(zhì)性肺炎、呼吸細(xì)支氣管炎伴間質(zhì)性肺炎相區(qū)分[8]。不僅如此，有研究證明MMP-7水平還可預(yù)測疾病的進(jìn)展，患者血清MMP-7<3.8 ng/mL的病情惡化時間與MMP-7≥3.8 ng/mL有顯著差異，閾值水平高的患者病情進(jìn)展的風(fēng)險要高2.3倍[9]。

四、CCL18

趨化因子配體18(CC chemokine ligand 18，CCL18) 是來源于M2型肺泡巨噬細(xì)胞的趨化因子，能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化急性加重期收集的支氣管肺泡灌洗液中CCL18含量較穩(wěn)定期的IPF增加，并且在特發(fā)性肺纖維化急性加重期期間，連續(xù)監(jiān)測支氣管肺泡灌洗液中CCL18水平，發(fā)現(xiàn)是呈升高趨勢，加上CCL18的水平與肺功能呈顯著負(fù)相關(guān)，可在一定程度上評估病情，判斷預(yù)后[10-11]。在一項納入72名IPF患者的前瞻性研究中結(jié)合多因素統(tǒng)計分析揭示，CCL18是可以預(yù)測IPF患者死亡率的生物標(biāo)志物：通過受試者工作特征曲線(Receiver operator characteristic curve，ROC曲線)分析，將CCL18臨界值定義為150ng/mL(靈敏度0.83；特異性0.77)，當(dāng)調(diào)整年齡、吸煙史、性別等數(shù)據(jù)后，血清CCL18水平>150ng/mL的患者與死亡風(fēng)險增加相關(guān)[12]。

IPF的潛在生物標(biāo)志物

一、PD-1、PD-L1

程序性死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)和程序性死亡分子配體-1(Programmed cell death1 ligand 1，PD-L1)皆為 B7 家族成員，PD-1表達(dá)在以T細(xì)胞為主的活化的淋巴細(xì)胞中，PD-L1是PD-1的主要配體，二者相結(jié)合可顯著使T細(xì)胞的新陳代謝減緩、細(xì)胞因子分泌減少，同時也使T細(xì)胞本身增殖、分化被抑制。眾所周知，PD-1在腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞上高表達(dá)，而PD-L1也在腫瘤細(xì)胞的表面上調(diào)[13]?？紤]到IPF與肺癌存在重疊的病理過程，國外學(xué)者逐步研究免疫檢查點PD-1和PD-L1在IPF中的作用，Celada等[14]發(fā)現(xiàn)IPF患者T細(xì)胞上PD-1表達(dá)明顯高于健康對照組，在動物實驗及細(xì)胞學(xué)實驗中證實PD-1是促進(jìn)肺纖維化的重要細(xì)胞因子，通過刺激STAT3信號通路上調(diào)促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和白介素17A(Interleukin-17A，IL-17A)，促進(jìn)膠原蛋白沉積。Jovanovic等[15]進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在IPF患者肺活檢組織的肺泡巨噬細(xì)胞上過表達(dá)，過表達(dá)PD-L1的巨噬細(xì)胞釋放促纖維化因子參與肺纖維化過程；并且血清PD-L1水平在IPF組為(117.7～483.1)ng/L，健康對照組為(52.4～119.7)ng/L，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PD-1、PD-L1均參與肺纖維化的過程，但仍需大樣本前瞻性的研究證實PD-1、PD-L1作為IPF生物標(biāo)志物的價值。

二、CD248

CD248又稱為內(nèi)皮唾液酸蛋白或腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1(Tumor endothelial marker 1，TEM-1)，是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)的一種跨膜糖蛋白。最初的研究認(rèn)為CD248在腫瘤組織中過表達(dá)，但隨著研究的進(jìn)展，CD248被發(fā)現(xiàn)在肝、腎、肺纖維化中表達(dá)升高[16]。有研究對22位IPF患者進(jìn)行肺組織活檢，免疫組織化學(xué)分析顯示，肺組織纖維化區(qū)域的成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞上CD248染色呈陽性，并且用數(shù)字圖像處理發(fā)現(xiàn)，CD248染色面積與肺功能參數(shù)和肺纖維化程度呈顯著負(fù)相關(guān)[17]。因此CD248對判斷IPF疾病的預(yù)后有一定的價值。該研究進(jìn)一步對比了正常來源和IPF來源的成纖維細(xì)胞CD248的表達(dá)，證實IPF來源的肺成纖維細(xì)胞中CD248蛋白水平顯著高于正常肺成纖維細(xì)胞[17]。

三、A2b腺苷受體

腺苷是一種內(nèi)源性核苷，通過結(jié)合細(xì)胞膜上的特定受體，發(fā)揮多種生理和病理調(diào)節(jié)作用，目前有4種腺苷受體，其中A2b腺苷受體是一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體，分布在廣泛的組織和細(xì)胞中。A2b腺苷受體的激活可導(dǎo)致慢性肺部疾病，包括纖維化[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者肺組織中A2b腺苷受體無論在基因還是蛋白層面表達(dá)均較正常對照組明顯增加[19]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，肺纖維化小鼠A2b腺苷受體的mRNA表達(dá)顯著增加，在用選擇性A2b腺苷受體抑制劑CVT-6883治療肺纖維化小鼠后，TGF-β1和ECM表達(dá)水平下降，A2b腺苷受體可能是通過激活TGF-β1/SMAD3信號通路促進(jìn)肺纖維化產(chǎn)生[20]。A2b腺苷受體作為IPF的生物標(biāo)志物存在不充分性，仍需大樣本重復(fù)的臨床研究來驗證。

四、YKL-40

YKL-40又稱幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1，屬于幾丁質(zhì)酶家族的一種糖蛋白，可由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等正常細(xì)胞產(chǎn)生，也可在一些惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，YKL-40能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化。有研究證實YKL-40的含量在IPF患者血清和支氣管肺泡灌洗液中明顯高于正常對照組，免疫組織化學(xué)技術(shù)也顯示在正常對照組的肺組織中幾乎沒有YKL-40表達(dá)，但在IPF患者肺組織纖維化病變區(qū)域YKL-40有表達(dá)，特別是在纖維化病變附近的肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)更明顯[21]。Korthagen等[22]發(fā)現(xiàn)，IPF患者表達(dá)YKL-40水平與CHI3L1-329基因型相關(guān)，不論在血清還是支氣管肺泡灌洗液中，GG基因型的YKL-40水平較AG基因型升高明顯，同時發(fā)現(xiàn)YKL-40水平提示疾病預(yù)后，IPF患者血清和支氣管肺泡灌洗液中YKL-40的含量分別低于各自的臨界值79 ng/mL、17 ng/mL時的生存率要比高于臨界值的患者生存率要高。

五、CCN1

細(xì)胞基質(zhì)蛋白CCN1又稱富半胱氨酸61(Cysteine-rich 61， Cyr61)是一種分泌型蛋白質(zhì)，參與血管生成、炎癥、損傷修復(fù)等過程。早在幾年前，就對CCN1與肺部相關(guān)疾病進(jìn)行研究，有不少的研究報道CCN1是急性肺損傷的生物學(xué)標(biāo)記物；并與慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌等疾病相關(guān)，也被認(rèn)為是這些慢性肺部疾病的潛在生物標(biāo)志物[23]。CCN1被發(fā)現(xiàn)在IPF肺組織的活動性纖維化區(qū)域高表達(dá)，研究證明CCN1通過TGF-β1/ SMAD3信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)肺纖維化[24]。高水平CCN1(≥0.147 ng/mL)IPF組中位生存時間為3.3年，低水平CCN1(<0.147 ng/mL)IPF組為5.7年，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且高水平CCN1 IPF組發(fā)生肺移植或死亡的風(fēng)險是低水平CCN1組的近2倍[25]。盡管如此，但仍需進(jìn)行更大規(guī)模的前瞻性研究來支持CCN1水平可能具有作為IPF預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。

六、抗凝血酶Ⅲ

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ)是絲氨酸蛋白酶抑制物超家族中的抗凝因子，主要由肝臟產(chǎn)生，釋放到血漿中的重要抗凝物質(zhì)。Meta分析提出IPF患者發(fā)生靜脈血栓的風(fēng)險，是一般人群的2倍[26]。有研究使用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(Isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)和質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitoring，MRM)這兩種定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)IPF患者AT-Ⅲ表達(dá)下調(diào)[27]。相反，Bergantini等[28]用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IPF組與健康對照組血清中AT-Ⅲ水平，IPF患者血清中AT-Ⅲ明顯升高，通過ROC曲線分析，定義AT-Ⅲ水平126.5 μg/mL為臨界值，將IPF患者分為2組，2組間IPF生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006 6)，并且AT-Ⅲ預(yù)測IPF生存率有較高的敏感性與特異性(曲線下面積0.93、敏感性1.00、特異性0.80)。以上兩種檢測手段雖對AT-Ⅲ的結(jié)果有些爭議，但無論哪種檢測方法，IPF與AT-Ⅲ都有相關(guān)性，Bergantini等還證實AT-Ⅲ的水平與FVC、第一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)呈顯著負(fù)相關(guān)[28]。由此看來，AT-Ⅲ有可作為評價IPF預(yù)后指標(biāo)的價值。

七、Galectin-1

半乳糖凝集素-1(Galectin-1，Gal-1)是β-半乳糖苷凝集素家族的成員之一，不僅在人體正常組織中表達(dá)，而且也在多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生、腫瘤血管新生、腫瘤細(xì)胞黏附、腫瘤免疫逃逸[29]。有研究分析了來自肺組織研究協(xié)會提供的160名IPF患者和108名健康對照者的肺樣本的微陣列數(shù)據(jù)集(GEO登錄號：GSE47460)，發(fā)現(xiàn)IPF患者肺部的Galectin-1水平上調(diào)，Galectin-1作為低氧反應(yīng)蛋白，在肺組織發(fā)生纖維化的低氧環(huán)境中表達(dá)增加，并激活TGF-β1/ SMAD3、ITGB1 / FAK1、Wnt信號通路促進(jìn)肺上皮細(xì)胞增殖，使其在成纖維細(xì)胞灶周圍增生[30]。另一項研究測定了IPF、結(jié)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化病相關(guān)的間質(zhì)性肺疾病和健康對照組支氣管肺泡灌洗液中Galectin-1的水平，發(fā)現(xiàn)IPF患者的Galectin-1水平與其他三個對照組相比有顯著差異，Galectin-1在IPF中表達(dá)更高，但結(jié)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化病相關(guān)肺間質(zhì)和健康對照組之間Galectin-1水平?jīng)]有明顯差異，Galectin-1可將IPF與非IPF相鑒別，并且在IPF患者中，Galectin-1與肺一氧化碳彌散量百分率(DLCO%)和肺一氧化碳轉(zhuǎn)移系數(shù)百分率(KCO%)呈顯著負(fù)相關(guān)[31]，提示Galectin-1可能與IPF疾病進(jìn)展相關(guān)。近幾年Galectin-1在IPF中的研究成果，使得Galectin-1作為IPF生物標(biāo)志物嶄露頭角。

八、LTBP2

轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白2(Laten transforming growth factor binding protein 2，LTBP2)是四種LTBPs亞型之一，能調(diào)節(jié)肺纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子TGF-β的激活[32]。Enomoto等[33]發(fā)現(xiàn)在IPF患者活檢肺組織中無論是應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)還是免疫熒光技術(shù)，纖維化間質(zhì)中LTBP2染色都呈陽性，而正常肺組織陽性反應(yīng)很少；同時檢測血清中LTBP2水平，IPF患者要顯著高于健康對照，急性加重期要顯著高于非急性加重期。有國內(nèi)學(xué)者進(jìn)一步研究LTBP2水平與IPF預(yù)后的關(guān)系，將120例IPF患者按預(yù)后效果分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LTBP2水平在預(yù)后不良組顯著高于預(yù)后良好組，并計算出預(yù)測患者預(yù)后不良的診斷界值為12.25 ng/mL[34]。

九、LOXL2

賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白2 (Lysyl oxidase-like 2，LOXL2) 與膠原蛋白重塑密切相關(guān)，可促進(jìn)纖維膠原的交聯(lián)和成纖維細(xì)胞增殖，在纖維化中起關(guān)鍵作用。兩個獨立的IPF隊列均顯示血清LOXL2水平與臨床指標(biāo)FVC和DLCO無統(tǒng)計學(xué)差異，但均與肺移植、因呼吸道疾病住院、死亡等疾病進(jìn)展相關(guān)，無論在哪個隊列中，LOXL2的水平越高，發(fā)生疾病進(jìn)展的可能性越大[35]。Aumiller等[36]對比5名健康對照和14名IPF患者肺組織切片，Masson染色顯示支氣管上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)中LOXL2的表達(dá)在IPF組明顯高于健康對照組，同樣，小鼠肺纖維化模型中LOXL2在肺上皮細(xì)胞與間質(zhì)區(qū)域表達(dá)升高。LOXL2通過TGF-β誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，構(gòu)建重塑ECM，使得ECM過度沉積，加上不論是在血清中還是肺組織中，LOXL2都在IPF中表達(dá)增加，證明LOXL2在肺纖維化中發(fā)揮著舉足輕重的作用，可作為一項預(yù)測IPF疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物。

存在的問題與展望

隨著近年來對IPF研究的逐漸深入，IPF相關(guān)的生物標(biāo)志物研究已取得不少進(jìn)展。除了上述的生物標(biāo)志物，還有骨膜蛋白、端粒、熱休克蛋白47等都被作為IPF的生物標(biāo)志物在研究。像CD248、A2b腺苷受體、CCN1 、Galectin-1等標(biāo)志物在IPF的相關(guān)研究中尚少，并且研究存在局限性，很多研究都來自觀察單個隊列，病例組的數(shù)量相對少，缺乏前瞻性。總之，仍然需要更進(jìn)一步的研究去探索IPF的生物學(xué)標(biāo)志物，需要更多的大樣本前瞻性研究的實施去證實生物標(biāo)志物與IPF的相關(guān)性，能為應(yīng)用于臨床做好充足的準(zhǔn)備。