外泌體MicroRNA在部分肺部疾病中的研究進(jìn)展

賀艷飛 郭小旭 姚培學(xué) 歐陽瑤

外泌體(Exosomes)是由細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物活性的納米級載體，普遍存在于大多數(shù)體液中。外泌體中富含的微小RNA(microRNA，miRNA)稱為外泌體miRNA，它是一種多功能非編碼RNA，對基因調(diào)節(jié)至關(guān)重要。外泌體miRNA在細(xì)胞間物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)遞中至關(guān)重要，參與炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而可能調(diào)節(jié)多種病理過程。外泌體已被視為當(dāng)前研究的熱點。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA在肺部疾病的發(fā)病機理中具有重要意義。本文旨在綜述有關(guān)外泌體miRNA在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、哮喘、特發(fā)性肺纖維化(IPF)和肺結(jié)核等常見肺部疾病中的研究進(jìn)展。

外泌體MicroRNA的概述及生物學(xué)特性

一、外泌體的概述

外泌體由晚期內(nèi)體即多囊泡體(multivesicular body，MVB)產(chǎn)生的直徑在30～150 nm的具有雙層脂質(zhì)膜的載體[1]。外泌體由大部分細(xì)胞分泌，普遍分布于血漿、血清、痰液和母乳等體液中[2]，其表面表達(dá)CD63、CD81、CD9等標(biāo)記蛋白。其可調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，也參與腫瘤的發(fā)病機理中[3]。也有報道，其在組織再生、靶向治療、人工外泌體模擬或作為生物標(biāo)記物中的潛力[4]。在呼吸系統(tǒng)疾病方面也取得了類似的進(jìn)展。研究表明，外泌體在肺癌、慢阻肺、哮喘、肺結(jié)核和間質(zhì)性肺病等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，可以從支氣管肺泡灌洗液(BALF)、唾液和痰等生物液中分離外泌體[6]。體液中外泌體含量的穩(wěn)定性歸因于其雙層膜結(jié)構(gòu)，并保護(hù)了它們作為潛在的生物標(biāo)記物。外泌體已被作為診斷腫瘤等疾病的生物標(biāo)記物及治療工具[7]。但在肺部疾病中，外泌體的研究正處于初始階段。Prado等[8]報道，哮喘小鼠的BALF衍生外泌體的給藥、抑制了IgE反應(yīng)和氣道炎癥。因此，外泌體可能是治療過敏性疾病的候選方式。另一種有望的診療策略是利用外泌體進(jìn)行氣道炎癥治療，即利用人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分泌的外泌體。

在實驗小鼠中，人MSC釋放的外泌體系統(tǒng)給藥可改善嗜酸性和中性粒細(xì)胞氣道過敏性反應(yīng)[9]。MSC衍生外泌體通過增加外周血中IL-10和TGFβ1表達(dá)而具有抗炎作用[10]。目前正在研究，以確定在哮喘或慢阻肺患者中使用MSC的療效性和安全性。利用外泌體進(jìn)行藥物傳遞具有一定的優(yōu)勢，低免疫原性和毒性的人工外泌體，可以傳遞如miRNA等生物成分給靶細(xì)胞。

二、外泌體MicroRNA的概述

miRNA是一種由內(nèi)源性基因編碼的18～22個核苷酸序列構(gòu)成的多功能非編碼RNA，作用于靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)[11]。miRNA是基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、死亡、激活細(xì)胞遷移、增強免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)血管生成等。細(xì)胞內(nèi)異常的miRNA可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的傳遞受損。miRNA作為腫瘤、糖尿病和脂質(zhì)紊亂等多種疾病潛在的無創(chuàng)生物標(biāo)志物[12]。miRNA表達(dá)譜，有望作為多種疾病有前景的生物標(biāo)志物，miRNA的檢測可以使用miRNA微陣列、面板型miRNA QPCR板等各種技術(shù)[13]。

外泌體包括miRNA、蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及脂質(zhì)等信號物質(zhì)，經(jīng)自分泌和旁分泌靶向作用于鄰近或遠(yuǎn)端細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞之間的信息交換從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能，在細(xì)胞動態(tài)平衡和調(diào)節(jié)生物行為過程中至關(guān)重要[14]。其中富含的miRNA稱為外泌體miRNA。近年報道集中在外泌體miRNA的功能上。Valadi等[15]報道，外泌體含有miRNA的存在，外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)使miRNA免受體液中的酶溶解而維持其穩(wěn)定性，還可攜帶并遞送miRNA至靶細(xì)胞進(jìn)而影響細(xì)胞的生物行為和病理生理的發(fā)展，其參與炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而可能調(diào)節(jié)多種病理過程。外泌體中包括多種RNA，但富含miRNA，其占總RNA的76.2%，以miRNA為主要生物活性物質(zhì)，外泌體中的miRNA的數(shù)量和類型不是隨機分配的，而是由細(xì)胞選擇性的分為外泌體內(nèi)含物。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA在慢阻肺、哮喘、IPF等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中具有重要意義[16]，且它們具有非免疫原性和快速提取的特點，因此，外泌體miRNA有希望作為肺部疾病的一種新的診斷和治療的生物標(biāo)志物。

外泌體MicroRNA與慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺病( Chronic Obstructive Pulmonary Disease，簡稱慢阻肺)是以氣道慢性炎癥引起的氣流受限為特點的慢性疾病。支氣管和肺泡上皮細(xì)胞作為宿主免疫防御的第一線構(gòu)成部分，當(dāng)受到刺激時，可分泌含有特定miRNA的外泌體分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，通過激活靜止干細(xì)胞和上皮細(xì)胞、并恢復(fù)其細(xì)胞周期從而促進(jìn)上皮損傷的修復(fù)[17]。此外，受到損傷細(xì)胞分泌的外泌體miRNA通過引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)清除有害應(yīng)激原及促進(jìn)組織修復(fù)來維持局部微環(huán)境的動態(tài)平衡，從而參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展[18]。據(jù)報道，吸煙者和非吸煙者的BALF中外泌體miRNA 的表達(dá)存在差異。Ezzie等[19]對比了健康吸煙者和慢阻肺患者的肺內(nèi)外泌體miRNA水平，在慢阻肺患者的肺中主要觀察到miR-223和miR-1274a的表達(dá)增加，提示外泌體miRNA在慢阻肺和非慢阻肺的吸煙者的肺中水平不同，另一項研究側(cè)重于特定的外泌體miRNA在慢阻肺發(fā)生發(fā)展中的作用，Conickx等[20]報道，與非吸煙者比較，無氣流限制的吸煙者和慢阻肺患者肺中的miR- 218-5p水平顯著降低；香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠和人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)中的miR-218-5p的表達(dá)也減少，重要的是，miR-218-5p的表達(dá)與氣道阻塞密切相關(guān)。此外，miR-218-5p在人和鼠肺中的細(xì)胞定位顯示BE中miR-218-5p的最高表達(dá)。用miR-218-5p模擬物或抑制劑進(jìn)行的動物實驗表明，miR-218-5p對香煙煙霧引起的氣道炎癥有保護(hù)作用[20]。BE與成纖維細(xì)胞的異常通訊對于氣道重塑至關(guān)重要，最近報道，外泌體miRNA通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可促進(jìn)慢阻肺的發(fā)展。Xu等[21]報道，香煙煙霧可以修飾外泌體miRNA，香煙煙霧刺激的HBE分泌的外泌體miR-21水平高于對照組，且HBE衍生的外泌體miR-21可作為成纖維細(xì)胞分化的介質(zhì)；在慢阻肺小鼠模型中，miR-21的表達(dá)減少減輕了煙霧刺激的氣道重塑，吸煙者和慢阻肺患者的血清中miR-21表達(dá)顯著升高，與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)[21]。Fujita等[22]研究表明，外泌體miR-210可能經(jīng)自噬途徑參與肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，慢阻肺和健康吸煙者的BALF中包括miR-338-3p、miR-204-5p 和 miR-618等23種外泌體miRNA的水平發(fā)生變化。這些差異表達(dá)的外泌體 miRNA 與TNFα、NF-κβ 和 MAPK 信號傳導(dǎo)等相關(guān)[23]，表明它們對慢阻肺中持續(xù)的炎癥反應(yīng)有影響。因此，外泌體miRNA有望作為慢阻肺診斷和治療的手段。

外泌體MicroRNA與支氣管哮喘

支氣管哮喘(bronchial asthma，哮喘)是氣道受到非特異性刺激引起的一類氣道炎性疾病，多種細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞等參與發(fā)病。氣道高反應(yīng)性(AHR)、氣道炎癥和氣道重塑是其發(fā)病機理的主要因素[24]。證據(jù)表明，哮喘相關(guān)細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞)釋放的外泌體miRNA可以充當(dāng)細(xì)胞間信息交換的介質(zhì)，從而促進(jìn)氣道炎癥、AHR和氣道重塑的發(fā)展。據(jù)報道，與健康人相比，哮喘患者的嗜酸性粒細(xì)胞中的MVB可釋放更多外泌體miRNA[25]。另一項報道，哮喘患者的嗜酸性細(xì)胞來源的外泌體miRNA可促進(jìn)小氣道上皮細(xì)胞的凋亡和支氣管平滑肌細(xì)胞的增生，這是造成氣道重塑的重要因素[26]。在某些情況下，盡管相同的外泌體miRNA可能在組織中減少，但氣道相關(guān)體液中的外泌體miRNA增加。在家塵螨(HDM)刺激的哮喘小鼠模型中，與空白組比較，模型組的BALF中外泌體miRNA明顯升高。這些外泌體miRNA上調(diào)了31個基因的表達(dá)，包括IL-13和IL-5Ra，它們分別是miR-346和miR-574-5p的推測靶點[14]。因此，當(dāng)特定的miRNA被外泌體攜帶并傳遞時，細(xì)胞內(nèi)基因被積極調(diào)控。Maes等[27]報道，與健康受試者相比，重度哮喘患者痰中三種外泌體miRNA(miR-629-3p，miR-223-3p 和 miR-142-3p)水平升高，miR-223-3p和miR-142-3p的表達(dá)與氣道阻塞(FEV1 / FVC)相關(guān)。HBE中 miR-629-3p 的上調(diào)誘導(dǎo)了促炎細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)，表明該外泌體miRNA可能與嗜中性哮喘的炎癥表型有關(guān)。Collison等[28]報道，在哮喘小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)miR145參與氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和上皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生；抑制miR-145表達(dá)時可減輕嗜酸性炎癥、粘液高分泌和AHR。因此，外泌體miRNA在哮喘的發(fā)病機制中具有重要意義，進(jìn)一步研究有望將外泌體miRNA作為生物標(biāo)記物候選物，可以鑒別哮喘及其類型，從而提高未來診斷和治療的有效性。

外泌體MicroRNA與特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是一種不可逆的、漸進(jìn)性的、原因不清的肺部疾病，可在診斷后2～3年內(nèi)導(dǎo)致死亡，IPF的特征是由纖維化“瘢痕”形成引起肺結(jié)構(gòu)進(jìn)行性和不可逆轉(zhuǎn)的破壞，最終導(dǎo)致器官破壞和呼吸衰竭而死亡[29]。在環(huán)境壓力的影響下，源自肺免疫細(xì)胞的外泌體的數(shù)量會急劇增加，其組成也會發(fā)生變化(如miRNA)。幾項研究表明，這些改變的外泌體miRNA與炎癥和纖維化相關(guān)的肺部疾病的進(jìn)展有關(guān)。Yao等[30]發(fā)現(xiàn)，在IPF大鼠模型中，M2巨噬細(xì)胞來源的外泌體過表達(dá) miR-328可促使肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖，并通過調(diào)節(jié)家族序列相似性13成員A(FAM13A)基因而促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展。Njock等[6]已發(fā)現(xiàn)3個miRNA(miR-142-3p，miR-33a-5p，let-7d-5p)在IPF患者的痰源性外泌體中與健康受試者相比異常表達(dá)。有趣的是，miR-142-3p與單位肺泡容積的彌散量(DLCO/VA)呈負(fù)相關(guān)，這表明痰中的外泌體miRNA與肺纖維化的程度有關(guān)。外泌體miR-29c具有保持上皮完整性，促進(jìn)損傷的修復(fù)，并減少纖維化的作用，動物實驗表明，與健康小鼠相比，IPF小鼠模型中II型肺泡上皮細(xì)胞中的外泌體miR-29c減少[31]。因此，外泌體中包括有益的 miRNA(如 miR-29c)可能是針對IPF的新型靶向治療模式。外泌體miRNA有希望作為IPF診斷、治療和嚴(yán)重程度評估的生物標(biāo)記物。

外泌體MicroRNA與肺結(jié)核

肺結(jié)核(Pulmonary Tuberculosis，PTB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的呼吸系統(tǒng)感染且具有傳染性的疾病。如果不被宿主的免疫防御系統(tǒng)清除，感染人體的Mtb會在宿主細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞)中存活[32]。因此，Mtb與宿主免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)之間的相互作用可能會影響結(jié)核病(TB)的發(fā)生與發(fā)展。感染了Mtb 的巨噬細(xì)胞可以將特定外泌體miRNA釋放到細(xì)胞外。研究證明，被牛分枝桿菌卡介苗感染的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞能夠釋放特定的外泌體miRNA，包括 miR-1224、miR-1293、miR-425、miR- 4467、miR-4732、miR-484、miR-5094、miR-6848、miR- 6849、miR-4488 和 miR-96[33]。Alipoor等[34]從11種表達(dá)量最高的外泌體 miRNA 中選擇3種外泌體miRNA(miR-484/miR-425 和 miR-96)作為診斷生物標(biāo)志物，以評估其對PTB的診斷價值。ROC曲線分析表明，血清外泌體 miR-484、miR-425和miR-96的AUC值分別為 0.72、0.66和0.62，并且通過涂片陽性程度發(fā)現(xiàn)三種血清外泌體miRNA與結(jié)核感染的程度密切相關(guān)?？紤]到這些表達(dá)不同的外泌體miRNA可能成為肺結(jié)核診斷的生物標(biāo)記物，需進(jìn)一步的研究以闡明這些外泌體miRNA參與肺結(jié)核的發(fā)病機制，從而開發(fā)診斷和治療該病的新靶點。

展 望

外泌體miRNA介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，成為研究熱點，越來越多的研究表明外泌體miRNA在肺部疾病(如慢阻肺、哮喘、IPF和肺結(jié)核)中的表達(dá)異常，在其發(fā)病機理中具有重要意義。本文主要闡述了外泌體miRNA在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用。探討了其作為生物標(biāo)志物的潛力，可能在臨床上用作診斷和管理肺部疾病的生物標(biāo)志物及治療手段。對慢阻肺、哮喘、IPF和肺結(jié)核等肺部疾病中的外泌體miRNA的研究尚處于起步階段，需要進(jìn)一步的研究外泌體miRNA介導(dǎo)肺部疾病的發(fā)病機理，并揭示它們在疾病進(jìn)展中扮演的角色。未來關(guān)于外泌體miRNA對呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制的貢獻(xiàn)的研究將為其在該領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供前景。