微RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)研究進(jìn)展

楊紫琳，趙雨娉，孫 武，陳 熹，姚瑋艷

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200025；2.天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化腫瘤科，天津 300060；3.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

微RNA(microRNA,miRNA)是真核生物體內(nèi)一類(lèi)長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，通過(guò)與靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）3’端非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合而介導(dǎo)翻譯水平的調(diào)控，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等幾乎所有生命活動(dòng)[1]。目前認(rèn)為miRNA 是未來(lái)疾病診斷、鑒別、預(yù)防、預(yù)后判斷以及治療的重要突破口[2-3]。部分基于miRNA 的治療手段也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，如miRNA122 拮抗劑米拉韋生（miravirsen）[4-5]、miRNA-34a 模擬 劑MRX34[6-7]等。

自然界中miRNA 存在不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄后修飾，這些修飾不僅提高了miRNA 多樣性，還可調(diào)控miRNA 表達(dá)水平及生物學(xué)作用效果，促進(jìn)其更精細(xì)、靈活、有效地發(fā)揮對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[8-10]。本文簡(jiǎn)要綜述了目前miRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)研究進(jìn)展，并對(duì)這些修飾機(jī)制的應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)價(jià)及展望，旨在為miRNA 修飾的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)和事實(shí)參考，更好地指導(dǎo)miRNA 的臨床應(yīng)用。

現(xiàn)有研究對(duì)于其轉(zhuǎn)錄后修飾的具體生物學(xué)效應(yīng)仍不甚明了。目前研究較多的轉(zhuǎn)錄后修飾為miRNA 末端無(wú)需模板的核苷酸添加 （non-templated nucleotide additions,NTA），主要見(jiàn)于3’末端（3’NTA）。另外，miRNA 已知的核苷酸修飾類(lèi)型有N6 甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、3’末端2’-O-核糖甲基化修飾、N7-甲基鳥(niǎo)苷（N7-methylguanosine，m7G）[11]。

miRNA 的3’NTA

2005 年Li 等[10]證實(shí)植物中未被甲基化的miRNA 在3’末端可非模板化添加尿苷酸及腺苷酸，隨后3’NTA 也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)存在于其他植物、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)中[12-14]，其中也包括小干擾RNA （small interfering RNA,siRNA）[15]、PIWI 蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA,piRNA）[16]，這可能是自然界中miRNA 普遍存在的自身調(diào)節(jié)機(jī)制。3’NTA 可見(jiàn)于miRNA 成熟體及前體，4 種核苷酸（尿苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鳥(niǎo)苷酸）均可對(duì)miRNA 進(jìn)行非模板化的添加[17]，其中最常見(jiàn)類(lèi)型為尿苷酸、腺苷酸。

一、miRNA 的3’末端尿苷化修飾

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)生物體內(nèi)miRNA 成熟體均存在3’末端尿苷化修飾引發(fā)的降解現(xiàn)象[10,12-14]。植物的尿苷酸轉(zhuǎn)移酶hen1 阻抑基因（hen1 suppressor 1，HESO1）及哺乳動(dòng)物的末端尿苷酸轉(zhuǎn)移酶 （terminal uridylytransferase 4,TUT4）/TUT7均可介導(dǎo)miRNA 3’ 末端的尿苷化修飾，并由此引發(fā)修飾后miRNA 的降解[18-19]。尿苷化也可作用于miRNA 前體（precursor miRNA,pre-miRNA），阻斷機(jī)體對(duì)前體結(jié)構(gòu)的加工并影響miRNA 成熟——果蠅體內(nèi)末端尿苷酸轉(zhuǎn)移酶CG1091，主要介導(dǎo)pre-miRNA 的3’末端尿苷化，影響Dicer酶對(duì)pre-miRNA 的特異性識(shí)別以阻礙成熟miRNA 合成[20]；有趣的是，let-7 前體的單尿苷酸化可促進(jìn)Dicer 酶的識(shí)別及對(duì)let-7 的加工過(guò)程，而在LIN28 存在下的寡尿苷酸化則阻止加工并誘導(dǎo)pre-miRNA 在干細(xì)胞和癌細(xì)胞中的降解，研究顯示在發(fā)育過(guò)渡和腫瘤發(fā)生過(guò)程中，尿苷化功能的兩面性可能有助于對(duì)let-7 表達(dá)的嚴(yán)格控制[21]，LIN28 介導(dǎo)let-7 的下調(diào)可能在發(fā)育、干細(xì)胞編程和腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用[21-22]。

尿苷化修飾還可以調(diào)節(jié)miRNA 的生物學(xué)活性。在對(duì)尿苷酸轉(zhuǎn)移酶Zcchc11 的研究中，Jones 等[23]證實(shí)了Zcchc11 通過(guò)介導(dǎo)miRNA 尿苷化抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）-1 相關(guān)miRNA 的沉默活性，增強(qiáng)IGF-1表達(dá)從而促進(jìn)新生小鼠的生長(zhǎng)與存活；類(lèi)似的研究中，靶向作用于白介素6 mRNA 的miRNA26，可被TUT4 介導(dǎo)進(jìn)行3’末端尿苷化修飾，但不影響自身穩(wěn)定性，反而降低了對(duì)機(jī)體白介素6 mRNA 的作用效果[24]，但關(guān)于末端尿苷化影響miRNA 生物活性的機(jī)制尚未明確。

二、miRNA 的3’末端腺苷化修飾

與尿苷化修飾相反，末端腺苷化修飾往往可增加miRNA 穩(wěn)定性。Lu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)毛果楊中miRNA 3’末端大多存在腺苷化修飾，修飾后其結(jié)構(gòu)更趨于穩(wěn)定而不易被降解；谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GLD)-2 介導(dǎo)的3’ 末端單腺苷化能夠選擇性地穩(wěn)定在人肝癌細(xì)胞株Huh7中明顯高表達(dá)的miRNA122[26]。在一些特殊情況下3’末端的腺苷化修飾反而能夠促進(jìn)降解，Wispy 是果蠅中GLD-2 的同源蛋白，與GLD-2 介導(dǎo)腺苷化miRNA 122 的高穩(wěn)定性不同，Wispy 促進(jìn)母源miRNA 腺苷化卻導(dǎo)致其豐度降低，起到清除母源miRNA 的作用[27]；類(lèi)似的研究中，Boele 等[28]發(fā)現(xiàn)poly（A）聚合酶PAP 相關(guān)結(jié)構(gòu)域（PAP associated domain containing，PAPD）5 介導(dǎo)人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1 中miRNA21 的3’末端腺苷化并刺激其降解，研究還進(jìn)一步證實(shí)機(jī)體存在一種末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶和核糖核酸外切酶的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以靶向特定結(jié)構(gòu)的成熟miRNA 以增強(qiáng)或防止其降解。

另外，近期研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA 如miRNA2909 等的3’末端尿苷化修飾與腺苷化修飾可能還參與了外泌體的分選機(jī)制[29]，這也從另一方面提示了尿苷化/腺苷化修飾兩者共同作為機(jī)體miRNA 的重要微調(diào)機(jī)制，對(duì)機(jī)體正常生命活動(dòng)的維持起重要作用，其表達(dá)譜的改變或可作為疾病診斷及鑒別的標(biāo)尺進(jìn)一步研究。

miRNA 的m6A

在高等真核生物mRNA 和長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，LncRNA）中，m6A 是最為普遍的內(nèi)部修飾，指的是RNA 鏈中的腺苷酸（A）上第6 個(gè)氮（N）原子上發(fā)生的甲基化修飾，其形成動(dòng)態(tài)可逆，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體[甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（methyltransferase-like protein，METTL）3、METTL14、腎母細(xì)胞瘤1-關(guān)聯(lián)蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）]、去甲基化酶[脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）、α-酮戊二酸鹽依賴(lài)性雙加氧酶AlkB 同源蛋白5（α-ketoglutaratedependent dioxygenase AlkB homolog，ALKBH5）]及相應(yīng)閱讀器[YTH 結(jié)構(gòu)域家族蛋白 （YTH domain family，YTHDF）、YTH 結(jié)構(gòu)域包含蛋白（YTH domain containing，YTHDC）、核內(nèi)不均一核糖核蛋白 （heterogeneous nuclear ribonucleo protein，HNRNP)A2B1、HNRNPC 等]協(xié)同調(diào)控[30]，廣泛參與哺乳動(dòng)物干細(xì)胞功能調(diào)控、腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過(guò)程[31-33]。

2015 年一項(xiàng)研究首次指出m6A 甲基化修飾同樣也存在于初級(jí)miRNA（primary miRNA,pri-miRNA），證實(shí)m6A 甲基化修飾能夠介導(dǎo)激活下游的微處理器迪喬治綜合征危象區(qū)基因（DiGeorge syndrome critical region gene，DGCR）8，促進(jìn)pri-miRNA 被DGCR8 特異性識(shí)別，啟動(dòng)并促進(jìn)primiRNA 向pre-miRNA 和成熟體miRNA 的加工，該研究還提出METTL3 的異常表達(dá)很可能會(huì)引起腫瘤中部分miRNA的異常高表達(dá)[8]；m6A 修飾水平對(duì)于人體正常穩(wěn)態(tài)具有重要作用，類(lèi)似的研究中，Alarcón 等[34]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中敲除m6A 結(jié)合蛋白HNRNPA2B1 可導(dǎo)致成熟miRNA 表達(dá)的減少和特定pri-miRNA 的核積累，其表型與METTL3 敲除結(jié)果相一致[8]。Berulava 等[35]在人胚胎腎293T 細(xì)胞（human embryo kidney 293T cell,HEK-293T） 中敲除介導(dǎo)m6A 去甲基化酶FTO 后，觀(guān)察到249 個(gè)上調(diào)和35 個(gè)下調(diào)的miRNA（＞1.5 倍變化）。

miRNA 的m6A 修飾對(duì)于臨床疾病的機(jī)制理解及治療具有重要指導(dǎo)意義：在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，香煙煙霧促進(jìn)pri-miRNA25 的m6A 修飾，增加成熟miRNA25-3p 的生成，而成熟miRNA 25-3p 可激活致癌性蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)-p70S6K 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展，與胰腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[36]；在肝癌細(xì)胞中，METTL14 作為甲基轉(zhuǎn)移酶可以激活DGCR8，以m6A 依賴(lài)性方式增加成熟miRNA126 表達(dá)水平，而miRNA 126 參與抑制肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的轉(zhuǎn)移，提示METTL14 可作為預(yù)防和治療HCC 的靶標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步研究[37]；此外，在黏菌素處理的小鼠腎小管上皮細(xì)胞（mice renal tubular epithelial cell,mRTEC）中過(guò)表達(dá)METTL3 后，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)miRNA m6A 修飾以正調(diào)節(jié)miRNA873-5p 的成熟過(guò)程，通過(guò)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 （Kelch-like epichlorohydrin associated protein 1,Keap1）/核因子E2 相關(guān)因子2 (nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)途徑抵抗黏菌素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，提出了m6A 修飾調(diào)控藥物對(duì)于黏菌素腎毒性的治療新見(jiàn)解[38]。

m6A 修飾是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的miRNA 生物合成過(guò)程中新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后修飾，其中參與m6A 修飾過(guò)程的各種小分子及蛋白的改變也可能影響miRNA 的生物合成及對(duì)基因的調(diào)控作用，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。然而到目前為止miRNA 的m6A 與疾病之間的相關(guān)研究仍較少，尚無(wú)m6A 是否也能夠發(fā)生在miRNA 的報(bào)道，對(duì)于m6A 是否會(huì)影響miRNA 的穩(wěn)定性以及是否參與miRNA 的選擇性分泌這些問(wèn)題尚無(wú)明確的解答。

miRNA 的3’末端2’-O-核糖甲基化修飾

2005 年，學(xué)術(shù)界首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶hen1能夠介導(dǎo)miRNA 3’末端2’-O-核糖甲基化修飾，即由甲基（-CH3）取代3’末端2’-O-核糖的一個(gè)自由羥基，使之提高自身穩(wěn)定性并且增強(qiáng)了其對(duì)RNA 酶如核酸外切酶、連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等的抵抗性，從而保證植物性狀的穩(wěn)定表達(dá)[9,39]。隨后多項(xiàng)研究表明昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種小分子RNA 如siRNA、piRNA 等均具有3’末端2’-O-甲基化修飾[40-41]。線(xiàn)蟲(chóng)中miRNA 也存在3’末端2’-O-甲基化修飾現(xiàn)象，其體內(nèi)HEN1 基因的敲除導(dǎo)致其miRNA 甲基化水平的降低，引起HEN1 突變體的生長(zhǎng)發(fā)育停滯[42]。另外，自然界中p21、p19、輔助成分蛋白酶（helper component proteinase,HC-Pro）等病毒RNA 沉默因子感染植物時(shí)，可通過(guò)抑制hen 1 來(lái)降低miRNA 甲基化水平從而大大降低機(jī)體性狀表達(dá)的穩(wěn)定性[43]。迄今為止，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為哺乳動(dòng)物體內(nèi)的miRNA 不存在3’末端2’-O-甲基化修飾，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)與piRNA 以及神經(jīng)元軸突內(nèi)的piRNA 樣非編碼小RNA（piRNA-like small RNA,piLRNA）上存在著甲基轉(zhuǎn)移酶hen1 同源蛋白（hen1 RNA methyltransferase，HENMT）1介導(dǎo)的3’末端2’-O-甲基化修飾[44-46]。

miRNA 的m7G

m7G 是轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、真核18S 核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和mRNA 分子帽位置中較常見(jiàn)的修飾之一。既往由于缺乏靈敏的檢測(cè)策略，m7G 在低豐度mRNA 和miRNA 中無(wú)法被檢測(cè)到。2019 年一項(xiàng)研究首次證實(shí)miRNA 中存在m7G，研究證實(shí)在人肺癌細(xì)胞A549 中，由METTL1 介導(dǎo)特定pri-miRNA（如let-7e 等）的m7G 修飾通過(guò)直接影響pri-miRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以獨(dú)特的方式促進(jìn)miRNA 成熟體的加工。該部分m7G 修飾的pri-miRNA 具有共同功能——抑制細(xì)胞遷移，研究提出m7G 途徑是miRNA功能的新型調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)miRNA 的結(jié)構(gòu)、生物發(fā)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，直接靶向METTL1 的治療思路可能作為未來(lái)一種有效且未經(jīng)探索的策略，有待進(jìn)一步探索[11]。

綜上，miRNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)于調(diào)控miRNA 自身穩(wěn)定性及生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要作用，可以使基因的沉默調(diào)控更為精準(zhǔn)化，其普遍性、保守性、特異性表明這可能是一種全新維度的表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控方式。盡管關(guān)于miRNA 在不同疾病中的作用機(jī)制及其轉(zhuǎn)錄后修飾的研究已取得一定進(jìn)展，但兩者之間的相互影響未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道，深入理解兩者之間的相關(guān)性有助于理解復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——在不同疾病的病理生理發(fā)展過(guò)程中，miRNA 除了表達(dá)水平發(fā)生改變外，其上游的加工修飾程度亦存在變化，是一種全新維度的表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控方式，有助于揭示miRNA 發(fā)揮作用的分子機(jī)制及作用方式，又可引導(dǎo)人們深入研究不同疾病發(fā)生、發(fā)展的新機(jī)制，其中任何能夠影響介導(dǎo)miRNA 修飾相關(guān)化合物的因素均可以影響miRNA 的生物合成及對(duì)基因的調(diào)控效果，這也將成為今后大多數(shù)miRNA 相關(guān)臨床技術(shù)手段開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)方向。將兩者應(yīng)用到臨床的早期診斷，在判斷腫瘤的復(fù)發(fā)情況、預(yù)測(cè)腫瘤療效和預(yù)后，以及開(kāi)發(fā)特異性靶點(diǎn)藥物等方面上具有很大的潛力。