熒光PCR技術(shù)在手足口病病毒核酸檢測中的應(yīng)用價(jià)值分析

羅瀅娟

（吉安市疾病控制中心，江西 吉安 343000）

手足口病是由腸道病毒引發(fā)的急性傳染性疾病，多發(fā)生于夏秋兩季，具有較強(qiáng)的流行性及傳染性，傳播途徑較為復(fù)雜，多發(fā)于年齡＜5歲的兒童[1]。腸道病毒71型（EV-71）及柯薩奇病毒A16 型（CoxA-16）是臨床常見的病原體，尤其是EV-71型病毒可引發(fā)腦膜炎等嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，威脅患兒生命安全[2-3]。因此，加強(qiáng)手足口病病毒核酸檢測可為臨床治療提供有利依據(jù)。既往臨床采用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)對手足口病病毒進(jìn)行檢測，但操作步驟復(fù)雜。近年來，熒光PCR技術(shù)在臨床上的應(yīng)用具有操作簡單、檢測時(shí)間短等優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)快速檢測的目的[4-5]。基于此，本研究旨在探究熒光PCR技術(shù)在手足口病病毒核酸檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年8 月至2019 年12 月本院收治的202 例疑似手足口病患兒，其中女92 例，男110 例；年齡2～11 歲，平均（5.98±0.84）歲；病程 2～7 d，平均（4.50±0.68）d。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒均表現(xiàn)出發(fā)熱、皮疹、口腔疼痛等臨床癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他腸道疾病；參與本研究前已服用治療藥物；依從性差，無法采集檢驗(yàn)標(biāo)本。

1.2 方法 采集疑似手足口病患兒的糞便樣本，冷藏并盡快送至實(shí)驗(yàn)室檢測，未能及時(shí)檢測的標(biāo)本置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存待檢。①熒光PCR技術(shù)檢測：提取腸道病毒RNA，使用適量0.9%氯化鈉溶液將糞便標(biāo)本重懸后取1.5 mL置于菌離心試管中，隨后加入100 mL氯仿及200 mL Trizol試劑，使用振蕩器振動離心試管20 s后靜置3 min，12 000 r/min冷凍離心2 min，離心結(jié)束后留取上層清液。在清液中加入10 PLRNA提取液A，充分振蕩搖勻后將混合后的溶液以8 000 r/min冷凍離心1 min 后棄上清液，于剩余溶液中加入400 mL 溶液C，充分振蕩搖勻后以8 000 r/min 冷凍離心1 min 后棄除上層液。將剩余溶液置于通風(fēng)櫥中通風(fēng)15 min，待瓶中出現(xiàn)白色沉淀后加入30 mL DEPC，充分搖勻呈白色懸濁液后行PCR擴(kuò)增。于PCR反應(yīng)管中加入2 mL逆轉(zhuǎn)錄酶系、3 mL Taq 酶系及相應(yīng)的RT-PCR 15 mL 反應(yīng)液，隨后加入5 mL 陰性質(zhì)控液、陽性質(zhì)控液及RNA 標(biāo)本懸濁液，其中PCR 反應(yīng)管總體積為25 mL，8 000 r/min 離心處理，后使用熒光PCR 儀行擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增條件如下：45℃環(huán)境逆轉(zhuǎn)錄10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃環(huán)境下變性15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃下15 s轉(zhuǎn)換為60 ℃，60 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，并于60 ℃行熒光信息采集。②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測：分別采用EV-71-A（下游）特異性吸引物、EV-71-S（上游）特異性吸引物、CA-16-A（下游）特異性吸引物、CA-16-S（上游）特異性吸引物對采集的樣本行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測。首先加熱試劑，使其變性，于60 ℃轉(zhuǎn)錄1 min，42 ℃轉(zhuǎn)錄10 min，50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃變性15 min，1 個(gè)循環(huán)。隨后于94 ℃變性20 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸40 s，在35個(gè)循環(huán)下完成引物與靶序列退火。最終72 ℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)后完成引物的延伸。待樣品擴(kuò)增后在電泳緩沖液作用下制成濃度為2%的凝膠，于100 V電泳30～40 min使用凝膠成像系統(tǒng)對樣本進(jìn)行分析。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較兩種檢測方法的EV、EV-71、CA-16病毒陽性檢出率，在樣品檢測中檢測結(jié)果為典型S型曲線且Ct≤35提示為陽性；檢測結(jié)果為無典型S型曲線或Ct＞35提示為陰性。②比較兩種檢測方法對手足口病的診斷情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法陽性檢出率比較 熒光PCR技術(shù)EV、EV-71、CA-16 病毒陽性檢出率均高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，EV+EV-71、EV+CA-16雙陽性檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1～2。

表1 兩種方法陽性檢出率比較[n（%）]Table 1 Comparison of positive detection rates between the two methods[n(%)]

表2 兩種方法雙陽性檢出率比較[n（%）]Table 2 Comparison of double positive detection rates between the two methods[n(%)]

2.2 兩種方法手足口病檢出率比較 202 例疑似患者中經(jīng)臨床確診122例，熒光PCR技術(shù)對手足口病檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩種方法手足口病檢出率比較[n（%）]Table 3 Comparison of detection rates of hand-foot-mouth disease between the two methods[n(%)]

3 討論

手足口病發(fā)生原因?yàn)楦腥疚改c道病毒，EV、EV-71、CA-16是導(dǎo)致手足口病發(fā)生的常見病原體，上述病原體可對患兒的神經(jīng)、循環(huán)、呼吸系統(tǒng)均造成一定程度的損傷，為減少各系統(tǒng)損傷對患兒的影響，故早診斷、早治療具有重要意義[6-8]。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及熒光PCR技術(shù)是目前臨床用于手足口病病原學(xué)檢測的常用方式，前者屬于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方式，在檢測中需對病毒進(jìn)行分離，隨后行中和實(shí)驗(yàn)及FLISA檢測，在此過程中病毒分離時(shí)間較長，對室溫要求及時(shí)間的長短均存在一定影響，若操作時(shí)間過長，或溫度控制不佳，可影響病毒核酸檢測[9-11]。而血清中和實(shí)驗(yàn)及FLISA檢測是利用病毒與患兒自身抗體間產(chǎn)生的反應(yīng)，靈敏度較低，在臨床檢測中存在一定局限性[12]。熒光PCR 技術(shù)則是采集患兒的糞便、體液等標(biāo)本進(jìn)行檢測，從而獲得病原診斷。該技術(shù)具有樣本采集方便、適用范圍廣等優(yōu)勢，不會對患兒身體造成傷害，且于檢測后3～4 h 內(nèi)即可得到有效診斷結(jié)果，可達(dá)到快速檢測的目的[13-15]。本研究結(jié)果顯示，熒光PCR 技術(shù)在EV、EV-71、CA-16 病毒陽性、EV+EV-71、EV+CA-16 雙陽性檢出率中均高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，且在手足口病中檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，表明熒光PCR 技術(shù)可有效檢出手足口病病毒，并對手足口病病原學(xué)進(jìn)行分型，可為臨床診斷及治療提供參考，以輔助患兒診治。

綜上所述，熒光PCR 技術(shù)在手足口病病毒核酸檢測中應(yīng)用價(jià)值較高，EV、EV-71、CA-16 病毒陽性檢出率高，可作為臨床診斷的首選檢測方式。