某醫(yī)院耐碳青霉烯酶類鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因研究和同源性分析

沈進(jìn)，孫少君，楊茜云，馬軍，王曉明，王秋波

（無錫市第九人民醫(yī)院（無錫市骨科醫(yī)院）檢驗(yàn)科，江蘇 無錫 214000）

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii，AB）是一種常見的醫(yī)院感染的非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，常引起傷口感染、尿路感染、皮膚軟組織感染、菌血癥等，特別是在重癥監(jiān)護(hù)病房中，還會(huì)導(dǎo)致免疫力低下人群發(fā)生院內(nèi)感染。由于醫(yī)院長期頻繁使用抗生素以及鮑曼不動(dòng)桿菌具有天然和獲得性耐藥能力[1-2]，使多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDR-AB）的分離率呈逐年上升趨勢(shì)。近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）也逐漸增多，檢出率可達(dá)32.04%[3]，已成為21 世紀(jì)醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)[4-7]。為了解CRAB在本院的流行現(xiàn)狀和院內(nèi)感染情況，本研究分析本院耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因及藥物敏感情況，并采用ERIC-PCR 方法進(jìn)行同源性分析，旨在減少院內(nèi)感染以及預(yù)防性臨床用藥提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 收集2019年1—11月本院患者入院采集的所有臨床標(biāo)本，包括患者的創(chuàng)口分泌物、痰液、中段尿等，排除同一患者相同部位的同一菌株。

1.2 方法 送檢的患者標(biāo)本參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第四版）進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定藥敏試驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)均采用BD Phoenixl00 NMIC/ID-4復(fù)合板上機(jī)自動(dòng)檢測(cè)，采用KB法檢測(cè)相應(yīng)藥敏補(bǔ)充試驗(yàn)，藥敏結(jié)果的判讀依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLIS）最新版標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。質(zhì)控菌株包括銅綠假單胞菌ATCC 27853，大腸埃希菌ATCC 25922，均由無錫市臨檢中心提供?？咕幬锛埰徸杂鳲xoid公司。

1.4 試劑及主要儀器 10×buffer、Taq酶、dNTP購自大連寶生物公司，PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR 擴(kuò)增儀使用MJ-PTC-100（BIO-RAD），凝膠成像儀器購自上海天能公司。

1.5 目的基因檢測(cè) 用煮沸法提取細(xì)菌DNA，用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè)碳青霉烯類耐藥基因，PCR 引物[8]詳見表1。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括DNA 模板5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Taq 酶0.25 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水33.75 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，并采用凝膠成像儀器判讀結(jié)果。

表1 目的基因引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Target gene primers sequences and length of products

1.6 同源性分析 采用ERIC-PCR 對(duì)OXA51 陽性菌株同源性分析，引物為5’-AAGTAAGTGACT-GGGGTGAGCG-3’反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，72 ℃ 8 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃16 min[9]，擴(kuò)增出的條帶相同為同一基因型，主條帶相同，負(fù)條帶相差1～2條為基因相似或密切相關(guān)，不符合上述條件者為不同基因型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用WHONET 5.6對(duì)多重耐藥菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選，并進(jìn)行菌株耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本分布 56 株CRAB 中來自于創(chuàng)口分泌物34 株，痰液 18 株，中段尿液 3 株，導(dǎo)管 1 株，其中 ICU 13 株，內(nèi)科 12株，其他31株分布于各個(gè)骨科，手外科病區(qū)，見表2。

表2 56株CRAB細(xì)菌標(biāo)本類型分布Table 2 Distribution of 56 strains of CRAB

2.2 藥敏結(jié)果 56株細(xì)菌的耐藥結(jié)果均為多重耐藥，22種藥物中18種藥耐藥性＞95.0%，且對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率均＞98.0%。耐藥率最低者為替加環(huán)素（9.6%），見表3。

表3 56株CRAB的藥敏結(jié)果Table 3 Suscepitbility rate of 56 strains of CRAB to antimicrobial agents

2.3 目的基因的PCR檢測(cè)結(jié)果 56株耐碳青霉烯酶類鮑曼不動(dòng)桿菌OXA51 基因PCR 檢測(cè)結(jié)果，48 株細(xì)菌陽性，陽性率為85.7%；OXA23 基因檢測(cè)結(jié)果，52 株細(xì)菌陽性，陽性率為92.9%。

2.4 ERIC-PCR結(jié)果 OXA23和OXA51陽性菌株同源性分析，38株屬于同一型，部分結(jié)果，見圖1。

圖1 OXA51菌株ERIC-PCR電泳圖譜Figure 1 ERIC-PCR electrophoresis of OXA51 positive strains

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院內(nèi)常見的獲得性病原菌，可引起不同類型的感染，從輕微的軟組織感染到更嚴(yán)重的感染，如呼吸機(jī)相關(guān)性感染和敗血癥等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012 年至2016 年非發(fā)酵革蘭陰性桿菌中，鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率一直居于第1位[10-11]。

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的機(jī)制主要包括碳青霉烯酶的產(chǎn)生[12]，細(xì)胞膜孔蛋白表達(dá)缺失或減少，青霉素結(jié)合蛋白的改變以及藥物外排泵的活性增強(qiáng)[13]，最主要的機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶[14]。本研究選擇四種碳青霉烯類酶中分布最廣，最重要的D 類-絲氨酸蛋白酶（OXAs）bla-OXA23、blaOXA51、blaOXA24、blaOXA58 四種作為研究對(duì)象。56 株 CRAB 中 ，OXA51 基 因 48 株 陽 性 ，陽 性 率 為85.7%，OXA23基因52株陽性，陽性率為92.9%，其他目的基因均為陰性。這可能由于OXA58型碳青霉烯酶在歐洲分布的較多，在我國分布較少，與李春等[15]研究結(jié)果相符。

含有ERIC序列等重復(fù)基因序列的細(xì)菌基因組可作為分子生物學(xué)工具來評(píng)估許多細(xì)菌分離株的細(xì)菌變異性。ERIC-PCR分析技術(shù)是區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌和其他導(dǎo)致醫(yī)院感染的革蘭氏陰性桿菌最快的分型技術(shù)之一。本研究結(jié)果表明，流行病學(xué)聯(lián)系在鮑曼不動(dòng)桿菌的分類上有一定的影響，對(duì)OXA51陽性菌株做ERIC-PCR分型，38株屬于同一型，分別分布于ICU、內(nèi)科、骨科，表明本院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制可能為產(chǎn)生OXA51型碳青霉烯類酶。

由于鮑曼不動(dòng)桿菌具有獲得性和上調(diào)耐藥的能力以及大量使用廣譜抗菌藥物，導(dǎo)致臨床選擇治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的藥物非常有限[16-17]。碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)，常被臨床用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌的感染，由于臨床的廣泛使用，導(dǎo)致其耐藥率呈逐年升高的趨勢(shì)[18]。有研究顯示，耐碳青霉烯類藥鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥，且多數(shù)僅對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素敏感的耐藥菌株。有研究顯示，不動(dòng)桿菌屬（鮑曼不動(dòng)桿菌占比93.4%）對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.0%和70.5%，2017年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥率接近66.7%[19-20]。由于CRAB 對(duì)常用藥物不敏感，一旦感染上CRAB，則面臨無有效藥物治療的情況[21-22]。

本研究藥敏結(jié)果顯示，本院分離出的CRAB全部為多重耐藥，且耐藥性較嚴(yán)重。亞胺培南和美羅培南的耐藥率均＞98.0%，22 種藥物中有18 種藥物耐藥率＞98.0%。耐藥率最低的藥物為替加環(huán)素，該藥是使用K-B 方法檢測(cè)的，可作為本院經(jīng)驗(yàn)用藥。本院56株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用藥物耐藥情況嚴(yán)重，主要菌株類型為OXA23 和OXA51 型，臨床需做好多重耐藥桿菌的防護(hù)感控以及隔離措施，實(shí)驗(yàn)室需做好耐藥性監(jiān)測(cè)，防止多重耐藥桿菌在醫(yī)院暴發(fā)流行。