“靈芝的實驗室培養(yǎng)”實驗設計*

劉開湘 （廣東省大埔縣大麻中學 廣東梅州 514299）

靈芝是一種珍貴藥材，被古人譽為“仙草”，具有補氣益血、養(yǎng)心、安神、利關節(jié)、止咳平喘等功效。現(xiàn)代認為，靈芝孢子粉有抗癌作用，藥效為靈芝的75 倍［1］。人教版選修1 開設了“微生物的實驗室培養(yǎng)”的專題實驗，為了培養(yǎng)學生學習微生物學知識的興趣，筆者通過靈芝栽培拓展設計實驗，讓學生在栽培實驗中學習微生物菌種及其來源，培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)，以及子實體形成、防止污染等微生物學基礎知識。

1 基礎知識

1.1 培養(yǎng)基配方 靈芝通常生活在腐樹或活樹木的根部，對木質素、纖維素等有很強的吸收、分解能力。采用木屑、棉籽殼、麥麩、米糠或農(nóng)作物秸稈作為原料，再補充適量氮源和水配制培養(yǎng)基。培養(yǎng)基原料組成如下：棉籽殼65%，麥麩20%，黃豆粉10%，石膏1%，石灰1%，磷酸二氫鉀1%，食鹽1%，蔗糖1%化水，總料:水=1∶1.3。不添加殺蟲劑 和抗生 素［2］。

1.2 無菌技術 對實驗操作的空間、培養(yǎng)室、操作者的衣著和手進行清潔、消毒；對實驗器具、接種工具和培養(yǎng)基（袋裝培養(yǎng)料）進行常壓蒸汽高溫消毒；接種等實驗操作在酒精燈火焰附近進行。

2 實驗操作

2.1 制備木質素培養(yǎng)基 培養(yǎng)基原料按配方比例稱量，按先多量、后少量順序混合，干翻至原料均勻，蔗糖水拌入料中，濕翻幾次至料粒均勻、濕水，并緊握培養(yǎng)料有水滲出但不下滴（含水量約60%）。選取長33 cm、寬15 cm 且一側封口的低壓聚乙烯塑料袋，每袋裝入攪拌均勻的培養(yǎng)料1.5 kg 左右，裝料時要先塞緊4 角，并按外實內松要求裝至16 cm 高，用塑料繩扎緊袋口。

2.2 培養(yǎng)基消毒 裝好料后要及時消毒，采用常壓蒸汽高溫消毒。為了消毒徹底，保持培養(yǎng)料在100℃的蒸鍋中連續(xù)消毒8～9 h。高溫消毒結束并冷卻至30℃以下時即可接種。

2.3 接種 采購靈芝栽培菌種用于接種。接種時嚴格執(zhí)行無菌操作，在接種時雙手入箱，用75%酒精擦手后，再用酒精擦洗菌種瓶外壁及接種鉤。將接種鉤在火焰上方充分灼燒、冷卻后打開菌種瓶蓋，轉動瓶口用酒精燈火焰滅菌，迅速挑取菌種接入料袋中，及時密封袋口。

2.4 發(fā)菌 接種前要對培養(yǎng)室的培養(yǎng)環(huán)境進行消毒和除蟲處理。接種后將菌袋置于培養(yǎng)室，平放在地面上層層堆積。發(fā)菌期間保持室溫和一定的濕度，白天保持有足夠的散射光。經(jīng)過30 d 左右的培育，菌絲發(fā)滿整個菌袋。

2.5 出芝 菌絲長滿后，用消毒后的刀片在袋口處劃開1 個出芝口，培養(yǎng)一定時間后出芝口會有乳白色的靈芝子實體原基形成。此時，保持濕度和通風，讓子實體開片。用噴水進一步加大空氣相對濕度，并加強通風透氣，促使靈芝菌蓋快速膨大。

2.6 孢子粉和子實體采收 組織學生進行采集孢子粉和采收子實體。在子實體即將成熟時，指導學生將滅菌后的采集袋罩在靈芝菌蓋外，采集袋的袋口扎緊在靈芝菌柄上，在采集袋下部開有一組通氣孔，位于靈芝菌蓋下方。一段時間后，將采集袋取下，收集采集袋內孢子粉，并用排筆毛刷收集靈芝菌蓋上的孢子粉。收集完孢子粉后，采收子實體，指導學生一手按住菌袋，一手握住子實體菌柄慢慢轉動，輕輕拔出靈芝。

3 實驗結果和分析

3.1 實驗結果 本實驗是微生物實驗室培養(yǎng)的拓展，生物學興趣小組經(jīng)過3 個月的實踐操作，取得了一定成果，收獲子實體30 個，采集子實體生產(chǎn)的孢子粉16.2 g。具體實驗結果見表1、圖1～圖4。

表1 靈芝的實驗室培養(yǎng)實驗的結果統(tǒng)計表

圖1 袋裝培養(yǎng)料

圖2 出芝

圖3 受污染的培養(yǎng)基

圖4 收集的孢子粉

3.2 討論和分析 實驗操作中，袋裝培養(yǎng)基制作和接種是成功的。但有6 袋培養(yǎng)袋沒有出芝，其中4 袋在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了被青霉等雜菌感染的情況。師生討論和分析認為：學生在制備培養(yǎng)料和接種過程嚴格按照操作程序進行，設備和培養(yǎng)室消毒得當，制料和接種的滅菌是嚴謹?shù)?。但在發(fā)菌過程中，培養(yǎng)料袋的翻動次數(shù)不夠、發(fā)菌時濕度過大等因素造成個別培養(yǎng)基發(fā)菌不理想。此外，在劃口出芝操作中，個別學生使用的刀片未經(jīng)嚴格消毒，導致培養(yǎng)基被青霉等雜菌污染，造成出芝失敗。通過實驗，學生深刻體會到微生物培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)物純凈和無菌操作的重要性。

實驗操作中，對靈芝菌種的來源進行了討論：接種的菌種是怎樣獲得的？收集的靈芝孢子粉是否可作為菌種進行接種栽培？師生通過討論后分析認為：靈芝屬于擔子菌，孢子是單核的擔孢子。在自然條件下，孢子長成單核菌絲，通過兩性單核菌絲結合成雙核菌絲進行繁殖。人工栽培中，靈芝孢子或單核菌絲不用于作菌種，母種可通過培養(yǎng)單核菌絲結合成雙核菌絲或通過子實體組織進行選擇培養(yǎng)而獲得，母種再經(jīng)過多次培養(yǎng)，制成大量的原種和栽培種。本實驗接種的菌種是靈芝栽培種。

4 實驗總結

本節(jié)實驗操作是教材實驗的拓展，從生產(chǎn)實例入手，構建“與社會聯(lián)系”的教學情境，讓學生體驗科學技術聯(lián)系社會［3］。讓原本略顯枯燥的微生物學實驗變得有趣而充滿收獲的成功感。實驗中充分發(fā)揮了學生的主動性，讓學生通過親身體驗和操作實踐，學習培養(yǎng)基的制備、接種和無菌操作等微生物培養(yǎng)的基本技能，在實踐中充分掌握“微生物的實驗室培養(yǎng)”的核心概念和知識。此外，通過理論聯(lián)系實際，學生拓展學習了靈芝栽培的菌種形成和靈芝繁殖的相關知識，有效激發(fā)了學習微生物學的興趣。