鹽脅迫下不同玉米自交系的耐鹽生理差異分析

王麗紅，豆昕桐，王英杰，王華忠，韓立森，岳潔瑜

（1.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；2.中國民航大學(xué)，天津300300）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中由于施肥和土壤灌溉不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致土地污染嚴(yán)重，鹽漬化問題日益突出.預(yù)計(jì)到2050年全球耕地將有50%發(fā)生鹽漬化[1-2].土壤鹽漬化會(huì)導(dǎo)致植物在生長發(fā)育過程中受到離子毒害、滲透脅迫、氧化脅迫等危害，進(jìn)而使細(xì)胞膜受損、根系脫水、代謝紊亂，植物光合作用下降，植物生長受到嚴(yán)重影響[3].宋陽等[4]研究發(fā)現(xiàn)，番茄遭受NaCl脅迫時(shí)，莖、葉中的Na+含量顯著增加，根、莖中的K+含量減少，葉片中的K+含量增加；Jiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下棉花幼苗生長受到嚴(yán)重抑制，葉片產(chǎn)生過量的過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2.-）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）；豆昕桐等[6]在研究小麥響應(yīng)不同濃度NaCl脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)，根和葉中的Na+、K+和Ca2+含量失衡，活性氧增加，葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨NaCl處理濃度和處理時(shí)間的延長發(fā)生顯著變化.植物也會(huì)通過一系列的生理反應(yīng)緩解鹽脅迫造成的損傷.如Abdelgawad等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下玉米根和葉片可通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶的活性增強(qiáng)耐鹽性；齊琪等[8]指出，在高Na+濃度的環(huán)境中維持胞質(zhì)中穩(wěn)定的K+濃度、增強(qiáng)自身保護(hù)酶活性是植物抵御鹽脅迫的重要措施；萬雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下甜菜可通過增加可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量以增強(qiáng)植株對鹽脅迫的適應(yīng)性.

玉米耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及諸多基因和多種耐鹽機(jī)制的協(xié)調(diào)作用[10-11].本研究對比分析了2種不同基因型玉米自交系PH4CV（鹽敏感型）和PH6WC（耐鹽型）在鹽脅迫下的生長生理、光合生理和逆境生理的變化規(guī)律，探討玉米響應(yīng)鹽脅迫的生理機(jī)制.研究結(jié)果可為玉米耐鹽育種和篩選提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 幼苗培養(yǎng)與鹽處理

以田間實(shí)驗(yàn)?zāi)望}性差異較大的2個(gè)玉米自交系（鹽敏感型PH4CV和耐鹽型PH6WC）種子為材料.選擇健康的玉米種子用蒸餾水浸泡12 h后，將種子擺放于鋪有雙層濕潤紗布的培養(yǎng)盆中，室溫培養(yǎng)，每隔2 d換一次蒸餾水.幼苗生長至一葉期時(shí)，用1/10 Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d更換一次營養(yǎng)液.培養(yǎng)幼苗至三葉一心期，平均分組后，分別用不同濃度的NaCl（0、10、25、50和100 mmol/L）進(jìn)行處理，每個(gè)處理重復(fù)3次.共處理9 d，每隔2 d取樣一次.

1.2 離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

分別隨機(jī)選取2個(gè)品種的對照組和處理組玉米幼苗，依次用自來水、蒸餾水和去離子水清洗后，分別截取根、莖、葉，置于108℃烘箱中殺青10 min，85℃烘干至恒重，研磨成粉末.用濃硝酸消化后，采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法測定玉米幼苗的根、莖、葉中Na+、K+、Ca2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ωNa+、ωK+、ωCa2+）.

1.3 MDA含量的測定

稱取0.2 g葉片或根，使用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入9倍體積的勻漿介質(zhì)，4℃、4 500 r/min下離心10 min，取上清液待測.使用植物丙二醛測試盒（A003-3，南京建成生物工程研究所）測定MDA含量，用酶標(biāo)儀（Infinite M200 Pro，瑞士Tecan公司）測定530 nm下的吸光度值，每個(gè)處理重復(fù)3次.

1.4 SOD和POD活性的測定

稱取0.3 g玉米葉片或根尖組織，置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，加入4倍體積的勻漿介質(zhì)，4℃、4 500 r/min條件下離心10 min，取上清液待測.用植物組織銅鋅-超氧化物歧化酶測定試劑盒（A004-1，南京建成生物工程研究所）測定SOD活性，使用酶標(biāo)儀測定550 nm下的吸光度值，每個(gè)處理重復(fù)3次.

稱取0.2 g玉米葉片或根尖組織，置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，按照鮮質(zhì)量（g）∶勻漿液體積（mL）=1∶9的比例加入pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），4℃、4 500 r/min條件下離心10 min，取上清液待測.采用愈創(chuàng)木酚法（A084-3過氧化物酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所）測定POD活性，測405 nm下的吸光度值，每個(gè)處理重復(fù)3次.

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

使用雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（Dual-PAM-100，上海澤泉科技股份有限公司），對不同濃度NaCl處理的玉米葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，包括初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv′/Fm′）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）、表觀電子傳遞速率（ETRⅡ）、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量（Y（Ⅱ））等[5-7].測定時(shí)間為8：30-11：30.實(shí)驗(yàn)前對玉米幼苗進(jìn)行20 min暗處理，選擇葉片中上部避開主葉脈進(jìn)行測定，每個(gè)處理重復(fù)4次.

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對2個(gè)品種玉米幼苗離子積累與分布的影響

不同濃度NaCl脅迫下，2個(gè)品種玉米幼苗不同部位的離子分布情況如圖1所示.由圖1（a）和圖1（b）可以看出，2個(gè)品種玉米幼苗的根系中，隨著NaCl濃度的增加，PH4CV中的ωNa+先上升后下降，可能是隨著NaCl濃度的增加，根中更多的Na+向地上部分轉(zhuǎn)移，ωK+和ωCa2+持續(xù)下降；PH6WC中的ωNa+持續(xù)上升，ωCa2+持續(xù)下降，ωK+先上升后下降.由圖1（c）和圖1（d）可以看出，隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米幼苗莖部的ωNa+均持續(xù)上升，ωK+均先上升后下降，PH4CV中ωCa2+先下降后上升，PH6WC中ωCa2+一直呈下降趨勢.由圖1（e）和圖1（f）可以看出，隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種葉片中的ωNa+均持續(xù)上升，PH4CV中ωK+緩慢上升，ωCa2+先下降后上升，PH6WC中ωK+先上升后下降，ωCa2+一直呈下降趨勢.

圖1 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗不同部位離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Mass fraction of ion in different parts of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

比較2個(gè)玉米品種，總的來看，相同鹽脅迫程度下，PH6WC中的ωK+和ωNa+均大于PH4CV中的數(shù)值，ωCa2+則略低于后者中的數(shù)值.

不同濃度NaCl脅迫下，PH4CV和PH6WC幼苗不同部位的ωK+/ωNa+如表1所示，ωCa2+/ωNa+如表2所示.

表1 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗不同部位的ωK+/ωNa+Tab.1 ωK+/ωNa+in different parts of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

表2 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗不同部位的ωCa2+/ωNa+Tab.2 ωCa2+/ωNa+in different parts of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

由表1和表2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米幼苗不同部位的ωK+/ωNa+均呈下降趨勢，PH6WC根、莖、葉和PH4CV莖、葉中的ωCa2+/ωNa+均呈下降趨勢，PH4CV根部ωCa2+/ωNa+呈先下降后上升的趨勢.比較不同部位，2個(gè)品種均是葉片中的ωK+/ωNa+、ωCa2+/ωNa+最高，根部數(shù)值最低.隨著NaCl濃度增加，PH4CV的根、莖、葉中ωCa2+/ωNa+和ωK+/ωNa+下降幅度更大.

2.2 NaCl脅迫對2個(gè)品種玉米幼苗MDA含量的影響

NaCl脅迫下，2個(gè)品種玉米幼苗根系和葉片中的MDA含量如圖2所示.由圖2（a）可以看出，在培養(yǎng)初期（＜3 d），隨著NaCl濃度的增加PH4CV根系的MDA含量呈上升趨勢，培養(yǎng)后期（6~9 d）MDA含量呈先上升后下降的趨勢，NaCl濃度為100 mmol/L時(shí)，MDA含量甚至低于對照組.由圖2（b）可以看出，在培養(yǎng)前期和中期（≤6 d），隨著NaCl濃度的增加PH6WC根系的MDA含量總體呈上升趨勢，在培養(yǎng)后期MDA含量呈先上升后下降的趨勢.由圖2（c）可以看出，在培養(yǎng)前期和中期（≤6 d），隨著NaCl濃度的增加PH4CV葉片的MDA含量總體呈上升趨勢，在培養(yǎng)到9 d時(shí)，MDA含量呈先上升后下降的趨勢；由圖2（d）可以看出，隨著NaCl濃度的增加PH6WC葉片的MDA含量除了在6 d時(shí)一直呈上升趨勢外，在其他時(shí)間內(nèi)都呈先上升后下降的趨勢.總的來看，在培養(yǎng)的前期和中期，2個(gè)品種根系和葉片中的MDA含量均隨著NaCl濃度的增加呈上升趨勢，在后期則呈先上升后下降的趨勢，NaCl濃度最大時(shí)，根系和葉片中的MDA含量均低于對照組的數(shù)值.

圖2 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗的MDA含量Fig.2 MDA content of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

比較2個(gè)品種，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl濃度下，PH6WC根系和葉片中的MDA含量均低于PH4CV中的含量.

2.3 NaCl脅迫對2個(gè)品種玉米幼苗SOD活性的影響

NaCl脅迫下，2個(gè)品種玉米幼苗根系和葉片中的SOD活性如圖3所示.由圖3（a）和圖3（b）可以看出，隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米幼苗根系的SOD活性均呈上升趨勢，PH4CV根系的SOD活性在6 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后略有降低；PH6WC根系的SOD活性在脅迫3 d內(nèi)呈上升趨勢，6~9 d內(nèi)隨著NaCl濃度的增加，SOD活性先上升后下降，之后再次上升.由圖3（c）可以看出，PH4CV葉片中的SOD活性在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)變化幅度較小；PH6WC葉片中的SOD活性隨著NaCl濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢.

圖3 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗的SOD活性Fig.3 SOD activity of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

比較2個(gè)品種，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl脅迫濃度下耐鹽品種PH6WC根系和葉片中的SOD活性均顯著高于鹽敏感型品種PH4CV中的活性，尤其是葉片中，前者葉片中的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后者中的活性.

2.4 NaCl脅迫對2個(gè)品種玉米幼苗POD活性的影響

NaCl脅迫下，2個(gè)品種玉米幼苗根系和葉片中的POD活性如圖4所示.由圖4（a）和圖4（b）可以看出，PH4CV根系中POD活性隨著NaCl濃度增加波動(dòng)較小，只是在培養(yǎng)后期波動(dòng)較大，POD活性在NaCl濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，之后下降；PH6WC根系的POD活性隨著NaCl濃度增加呈緩慢上升趨勢.由圖4（c）和圖4（d）可以看出，2個(gè)品種玉米葉片中的POD活性隨著NaCl濃度增加波動(dòng)幅度均較小.比較2個(gè)品種，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl脅迫濃度下，PH6WC根系和葉片中的POD活性均略低于PH4CV中的活性.

圖4 不同濃度NaCl脅迫下PH4CV和PH6WC幼苗的POD活性Fig.4 POD activity of PH4CV and PH6WC seedlings under various concentrations of NaCl stress

2.5 NaCl脅迫對2個(gè)品種玉米幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

不同濃度的NaCl脅迫下，2個(gè)品種玉米幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化如圖5所示.由圖5可以看出，隨著NaCl處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長，2個(gè)品種玉米幼苗葉片的Y（Ⅱ）、ETR（Ⅱ）、qP均呈下降趨勢，NPQ呈上升趨勢.比較2個(gè)品種玉米幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl脅迫濃度下，耐鹽品種PH6WC葉片的Y（Ⅱ）、ETR（Ⅱ）、qP均大于鹽敏感型品種PH4CV幼苗葉片的數(shù)值，NPQ小于PH4CV幼苗葉片的數(shù)值，培養(yǎng)時(shí)間越長NaCl處理濃度越大，二者之間的差異越顯著.

圖5 不同濃度NaCl脅下PH4CV和PH6WC幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.5 Chlorophyll fluorescence parameters of PH4CV and PH6WC seedlings leaves under various concentrations of NaCl stress

3 討論與結(jié)論

土壤鹽漬化可通過滲透脅迫擾亂作物礦質(zhì)離子正常含量，抑制營養(yǎng)元素吸收，造成植株離子失衡[12].Na+是引起作物受到單鹽毒害的主要離子，K+是作物所需的營養(yǎng)元素，可以維持作物正常代謝，Ca2+可以緩解Na+的毒害，維持細(xì)胞的穩(wěn)定性和完整性[13].本研究比較了2種不同基因型玉米自交系PH4CV（鹽敏感型）和PH6WC（耐鹽型）對鹽脅迫的抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米幼苗根、莖、葉中Na+含量明顯增加，PH4CV根系中K+含量減少，莖、葉中K+含量增加，而PH6WC根、莖中K+含量增加，葉中K+含量逐漸減少；2個(gè)品種玉米根、莖中Ca2+含量降低，PH4CV葉片中Ca2+含量較對照組增加，PH6WC葉片中Ca2+含量較對照組減少.鹽脅迫下，礦質(zhì)營養(yǎng)元素與Na+的比值是衡量作物耐鹽性的重要生理指標(biāo)[14].本研究中，隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米根、莖、葉部位ωCa2+/ωNa+和ωK+/ωNa+均逐漸降低，全株中葉片部位的數(shù)值最大，說明NaCl脅迫明顯降低了根系對Ca2+、K+營養(yǎng)元素的吸收，葉片離子含量受滲透脅迫影響最小.PH4CV根、莖、葉中ωCa2+/ωNa+和ωK+/ωNa+下降幅度更大，表明該品種玉米幼苗的營養(yǎng)元素吸收受到的抑制作用更顯著，這與陳勛基等[15]在分析玉米幼苗耐鹽性差異時(shí)得到的結(jié)果一致.

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的終產(chǎn)物，其含量高低可反映NaCl脅迫對作物的氧化損傷[16].王婧澤等[17]在研究玉米響應(yīng)鹽脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增大MDA含量呈先上升后降低的變化趨勢，表明處于鹽脅迫下的玉米細(xì)胞損傷程度逐漸增大，MDA含量增多，但當(dāng)玉米細(xì)胞膜脂過氧化損傷較嚴(yán)重時(shí)，脅迫對玉米幼苗的損傷不可逆轉(zhuǎn)，從而MDA含量降低.本研究中NaCl濃度小于100 mmol/L時(shí)，處理組玉米葉片和根系的MDA含量較對照組均明顯增加；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到100 mmol/L、處理幼苗9 d時(shí)，2個(gè)品種玉米幼苗的MDA含量總體上低于對照組的數(shù)值.比較2個(gè)品種，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl脅迫濃度下耐鹽品種PH6WC根系和葉片中的MDA含量均低于鹽敏感型品種PH4CV中的含量.

為了緩解逆境造成的損傷，植物保護(hù)酶系統(tǒng)能夠發(fā)揮清除ROS的重要作用，SOD、POD是保護(hù)酶的重要組成部分[18].吳雪霞等[19]在研究高溫脅迫對茄子果皮ROS代謝影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，茄子果皮中POD和SOD活性增強(qiáng).劉艷麗等[20]的研究結(jié)果表明POD活性的增強(qiáng)可以顯著提高小麥幼苗的耐鹽性.本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下2個(gè)品種根和葉片中的POD和SOD活性均高于對照組的數(shù)值，這與吳雪霞等[19]、劉艷麗等[20]的研究結(jié)果一致.比較2個(gè)品種，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，相同NaCl脅迫濃度下，PH6WC植株中的SOD活性顯著高于PH4CV中的數(shù)值，POD活性略低于PH4CV中的數(shù)值，這說明耐鹽品種玉米PH6WC主要是通過提高SOD活性來緩解鹽脅迫造成的損傷.

在鹽脅迫下，植物體的許多生物機(jī)能會(huì)受到抑制，其中光合作用對鹽脅迫比較敏感.測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)是分析植物光合作用的重要方法，可提供葉片PSⅡ系統(tǒng)和電子傳遞過程的信息[21].本研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的增加，2個(gè)品種玉米幼苗的Y（Ⅱ）、ETR（Ⅱ）、qP等主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)均呈下降趨勢，NPQ呈上升趨勢，相同NaCl處理濃度下，PH6WC葉片的Y（Ⅱ）、ETR（Ⅱ）、qP均大于PH4CV的數(shù)值，NPQ小于PH4CV的數(shù)值.孫菲菲等[22]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導(dǎo)致不結(jié)球白菜光合色素含量下降，NPQ呈上升趨勢，PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量、ETR等呈下降趨勢，本研究結(jié)果與之一致，說明NaCl處理對2個(gè)品種玉米幼苗的光合膜結(jié)構(gòu)造成不同程度的損傷.比較2個(gè)品種，PH4CV葉片的光合系統(tǒng)受損更加嚴(yán)重.

總的來看，鹽脅迫均能夠顯著抑制玉米2個(gè)品種幼苗的生長，相同處理?xiàng)l件下，耐鹽品種PH6WC的生長情況好于鹽敏感型品種PH4CV.PH6WC的K+含量、SOD活性較高，MDA的含量相對較低，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Y（Ⅱ）、ETR（Ⅱ）、qP等較大，說明PH6WC可通過降低MDA含量、增加SOD活性和緩解PSⅡ系統(tǒng)所受損傷來緩解鹽脅迫對小麥的傷害效應(yīng).